wb膜封闭液怎么配置
① 做WB为什么用牛奶封闭能显出来 用BSA就显不出来了
在蛋白印迹 WB 实验的封闭环节，我们经常疑惑该用脱脂牛奶还是牛血清白蛋白(BSA)来封闭，这两种封闭稀释液对实验有什么影响？
首先，我们需要了解封闭的目的：减少因非特异性结合而产生的背景。其次，我们需要知道 BSA 和牛奶的区别：BSA 仅由一种蛋白组成，即 60 kDa 的牛血清白蛋白；而牛奶则由许多大小不一的蛋白构成。
所以，CST (Cell Signaling Technology) 推荐牛奶封闭最佳，因为牛奶有更大的机会来减少更多的非特异性结合。我们建议您用经 TBST 稀释的 5% 牛奶，在室温下摇晃一小时，来封闭CST所有非偶联一抗，这包括磷酸化特异性和总抗体。
现在，曾有同学问过，“牛奶中的磷酸酶会怎么样？” 或许有一些文章反对使用牛奶来检测磷酸化信号，这一误区的出现可能是由于实验者使用了非实验级奶粉引起的（国内许多奶粉含有磷酸酶等杂质），但在 CST 的所有内部检测中，科学家们进行了多次蛋白印迹实验，从未发现任何这样的问题。CST建议转膜后迅速在TBS中洗涤膜几秒，以便移除残留的转膜缓冲液，随后使用5%脱脂牛奶（请使用实验级的#9999）的TBST室温封闭1h。另外，CST科学家们每天至少要新鲜配制一次牛奶，有时甚至一天配制多次，因为如果牛奶缓冲液放置了一周、两周甚至更长时间不使用，那么磷酸酶影响信号的机率将会增加。
上图是(Phospho-Akt (Thr308) (D25E6) XP® Rabbit mAb) #13038 用来检测经 PDGF 处理的 3T3 细胞裂解物的结果图片。左侧膜是用牛奶封闭，右侧膜用 BSA 封闭。显然，用 BSA 封闭的膜的背景更高。但用牛奶封闭膜时，磷酸化信号仍然很强且清晰。
封闭后，请仔细查看一抗的说明书，根据推荐的一抗缓冲液来稀释一抗，一般推荐牛奶或 BSA，但取决于不同抗体。
② wb洗膜配置
wb洗膜配置1X转膜缓冲液采用甘氨酸2.9g、Tris 5.8g、SDS 0.37g、浓盐酸1.8 ml 、蒸馏水至800ml、加甲醇200ml定容至1000ml。
10X 转膜缓冲液的配置是甘氨酸151.1g、Tris 30.3g、蒸馏水至1000ml
溶解后室温保存，用时稀释10倍，并加入甲醇至20%。通常取80ml母液，加560ml蒸馏水，最后加160ml甲醇，配制成800ml即可。（先加甲醇易产生沉淀）。
③ wb脱脂牛奶怎么配
推荐用TBST进行稀释获得5%的牛奶封闭（5g/100mL）。脱脂牛奶封闭后背景比较干净，而检测磷酸化蛋白则用BSA（因脱脂牛奶含有较多的磷酸化蛋白，会干扰的）。
一、牛血清白蛋白(BSA)，又称第五组分，是牛血清中的一种白蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66、430 kDa，等电点为4、7。牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用，例如在western blot中作为Blocking agent;在酶切反应缓冲液中加入BSA，通过提高溶液中蛋白质的浓度，对酶起保护作用。防止酶的分解和非特异性吸附，能减轻有些酶的变性，能减轻有些不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的变性。
二、用途说明：
1、 在酶切反应缓冲液中加入BSA，通过提高溶液中蛋白质的浓度，对酶起保护作用。防止酶的分解和非特异性吸附，能减轻有些酶的变性，减轻不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的变性的。
2 、ELISA中也常常用到，比如封闭液，样本稀释液，酶结合物稀释液都可以用BSA。
3、生化研究，遗传工程和药物研究。
④ southern blot 牛奶封闭液如何配置
Southern Blot 为什么要配牛奶封闭液啊？是最后孵育的一部要加抗体吗？
如果是封闭抗体的话，一般就配5%的脱脂奶粉，5%多半指的是个g/100ml。也就是5g奶粉，100ml水的比例，完全溶解即可。如果担心牛奶里面有小颗粒没有溶解，可以用0.22um的膜过滤一下，防止有颗粒在膜上形成斑点的背景。
⑤ western blot中封闭起什么作用
转膜后，膜上其他的空白位置需要用封闭液封闭。Western的灵敏度某种程度上受限于封闭做的好不好。
在做Western blot实验中，会用到固相载体(如NC膜，PVDF膜)，在这些固相载体表面有很多洞洞，通过电转，胶上的蛋白被转移到膜上，蛋白以机械填补(堆积)和吸附的方式结合于表面。
蛋白塞进了表面的很多洞洞里面，但是蛋白并不是连续的，而有很多空隙，抗体也是蛋白，也会被吸附在空的洞里，这样就会有很多非特异性的信号。
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封闭液中的蛋白可以与固相载体表面的空白位置结合，以机械填补(堆积)和吸附覆盖的方式结合在膜上，填补和覆盖蛋白结合位点以避免非特异性结合。同样，这两种作用使封闭液中的蛋白能够狠牢固结合在空白位置上，这样抗体蛋白就不会被非特异性的吸附到膜上，而只会跟特异性蛋白结合。
封闭液应封闭所有的未结合位点而不替换表面上的靶蛋白，不结合靶蛋白表位，也不与抗体或检测试剂有交叉反应。
转膜后，膜上其他的空白位置需要用封闭液封闭。Western的灵敏度某种程度上受限于封闭做的好不好。
⑥ 配wb脱脂奶粉封闭液是用tbst还是tbs
用加脱脂奶粉封闭液用TBST液显色用红外荧光二抗则能用TBS液稀释
⑦ 求封闭液中1%的BSA是怎么配制
取1g BSA，加蒸馏水，定容到100ml就行了。
最常用的封闭剂是0.05%-0.5%的BSA，封闭是否必要，取决于ELISA的模式及具体的实验条件。并非所有的ELISA 固相均需封闭，封闭不当反而会使阴性本底增高。
一般说来，双抗体夹心法，只要酶标记物是高活性的，操作时洗涤彻底，不经封闭也可得到满意的结果。
特别是用单抗腹水直接包被，因其中大量非抗体蛋白在包被时同样也吸附在固相表面，业已起到了类似封闭剂的作用。但在间接法测定中，封闭一般是不可少的。
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判断封闭条件，要考虑在此条件下是否能达到试验要求，即棋盘滴定要满足：阳性样品OD=0.8、阴性样品OD<=0.1，而不是看你待测样品OD变化趋势;
过低封闭浓度势必造成本底过高，但过高又会使灵敏度降低，因此只要选择能够满足你试验要求的最低BSA浓度就可以了。
另外提醒，洗涤一定要彻底，很重要的。
包被后封闭前一般要洗涤一遍，以便于洗掉结合不牢固的包被物，防止在实验中影响实验结果;封闭后一定不要洗涤，封闭的目的就是要靠蛋白填补未被包被物占领的空间，另外封闭液一般也具有保护作用。
如果不是用biotin-avidin系统的话，用5%脱脂奶粉做封闭液就可以了，廉价，效果也很好。
封闭液一般是用5%的BSA或者是用5%的脱脂奶粉，溶剂一般使用TBST。做实验的时候，我一直强调这样的一个原理，那就是在了解原理的基础之上，我们完全可以不拘泥于书本，进行创造。就拿这个封闭液来讲，要是单纯的一种封闭效果仍然不好的话，我们完全可以两种合用，我就试过1%的BSA和5%的脱脂奶粉合用进行封闭的事例。所以，搞科学研究是需要我们进行再创造的。
D、BSA交联抗原注射到兔子体内得到一抗，我们Elisa的二抗用的是羊抗兔HRP标记的二抗。请问，在封闭时，用什么样的封闭液比较好呢?是无蛋白封闭液，还是羊的免疫前血清?
⑧ WB封闭液与一抗稀释液一定要一致吗
要一致。用牛奶封闭就用牛奶稀释，BSA封闭就BSA稀释。高保真生物技术有限公司，实验整体外包服务商。you can contact me, Q :four zero six zero eight eight four six three
⑨ WB封闭温度和时间
WB封闭温度是38度1个小时就可以了。
如果是自己配置的封闭液，最好过滤一下以消除固体杂质。