384孔板定量体系如何配置

Ⅰ 目前环境分析用的液相色谱都是什么配置的，主流型号和大概价格，国外的牌子。请各位高手指点！

品牌 安捷伦 型号 1100
类型 制备液相色谱

产品描述：原产地： 美国
Agilent 1100系列面向行业，面向法规为液相色谱制定了新的行业标准。自1996年间世以来，在全球我们已经安装超过130,000台1100组件和55,000多套化学工作站数据处理系统，成为目前单一型号市场占有率最高的液相色谱系统。 Agilent 1100系列组件外形设计独特、具有灵活多变的组合方式；卓越的系统性能指标；图形化的工作站友好界面；智能化维护系统和全面完善的法规认证功能，不断创新推出的新组件，完善安捷伦液相色谱的分析领域。

全系列Agilent 1100泵系统
● 电子流控阀(EFC)控制的毛细液相泵系统，精度高、流速范围广 柱流速范围：1-20ul/min;10-100ul/min（可选件）
0.001-2.5m1/min(EFC关闭状态)
● 高压制备泵系统，单元或双元高压制备泵
流速范围:0.001-100m1/min
● 分析型泵系统
流速范围：
单元泵：0.001-10m1/min
二元泵：0.001-5m1/min
四元泵：0.001-10m1/min

品种齐全的Agilent 1100系列进样系统
● 标准手动进样器（分析型或制备型）
● 标准自动进样器
样品瓶容量：可达100个(2mlx100)
进样量：0.1-100ul(0.1-1800ul)可选件
● 微盘式自动进样器
样品瓶容量：2x96(孔板)，2x386(孔板)或100x2ml
进样量：0.1-100ul(标准件)
0.1-1500ul可选件
● 微量标准自动进样器/微盘式自动进样器
进样量：0.01-8ul（标准）;0.01-40ul（可选）
● 恒温标准自动进样器/微盘式自动进样器
温度范围：4-40℃可设定步进1℃
● 220型微孔板式自动进样器－组合化学样品管理系统
样品瓶容量：各种规格试管 多达12个微孔板（96孔板,384孔板）
进样量：0.1-5ul;0.1-20ul

Agilent 1100系列检测器
● 可变波长扫描紫外检测器（VWD)
波长范围：190?600nm
● 多波长检测器(MWD)
波长范围：190?950nm（双灯源）
● 二极管阵列检测器(DAD)
波长范围：190?950nm（双灯源）
● 荧光检测器(FID)
激发波长：200-700nm;
发射波长:280-900nm
光谱存储：全光谱
● 示差折光检测器(RID)
温控：室温+5℃至55℃
内置自动吹扫阀和自动溶剂循环阀
● 电化学检测器(ECD)
● LC/MS四极杆质量检测器(MSD)
● LC/MS离子阱质量检测器(Trap MSD)
柱温箱和脱气机组件
● 柱温箱
温度范围：室温下10℃至80℃
可选件：柱切换阀
● 真空在线脱气机

Ⅱ 384孔板是几乘几

384孔板365-450-465nm。

380-385nm带风扇开关紫外线灯板。

390*410带风扇紫外灯板。

420-430nm带风扇开关暗紫蓝灯板。

440-445nm带风扇开关纯蓝光灯板。

440-475nm带风扇全蓝光波长灯板。

450-455*465-475nm带风扇蓝灯板。

455-460*495-500nm带风扇灯板。

普通微孔板：

主要是96、384孔板的外观尺寸基础上，保持长、宽符合SBS国际规范的同时，增加孔的深度，以此达到增加每个孔的容积的目的。并且为了适应其特定的使用范围，一方面通过改变制造材料现多用聚丙烯（PP），个别用聚苯乙烯（PS），另一方面通过改进表面处理工艺，进而制作成的一类实验室板材。

1 、按孔数分类，较常见的可分为96孔板、384孔板。

2、按孔型分类，96孔板主要可分为圆孔型和方孔型。其中384孔板全部为方孔型。

3、按孔底形状分类，常见主要有U型和V型两种。

Ⅲ 高通量qPCR芯片是如何构建纳米反应体系和检测

答：获得原始实验样品后，对样本中的微生物总DNA进行提取，之后对DNA样品进行总量及纯度检测。检测合格后将DNA样品和qPCR所用的试剂添加至384孔板作为样品板（Sample Sourceplate），同时将引物和qPCR所用的试剂添加至另一384孔板作为引物板（Assay Sourceplate）。采用高通量自动微量加样设备分别将样品板和引物板试剂添加至高通量qPCR芯片的纳米孔中，在SmartChip Real-Time PCR System中实行qPCR反应及荧光信号检测，并自动生成扩增曲线和溶解曲线。

Ⅳ 384孔板每孔加多少体积

100ul体积和200ul体积。384孔板每孔加多少体积是100ul体积和200ul体积，根据不同的机型，选择不同高度的孔板，避免因高度误差和受热不均导致数据失真而损坏机器。

Ⅳ 实时荧光定量 PCR

    实时荧光定量 PCR ，简称 RT-QPCR, 属于 Q-PCR 的一种，目前该技术已得到广泛应用，如：扩增特异性分析、基因定量分析、基因分型、 SNP 分析等。荧光定量 PCR 常用的方法是 DNA 结合染料 SYBR GreenⅠ的非特异性方法。

    SYBR Green I 是一种结合于所有 dsDNA 双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的荧光染料， 可与所有的各种序列的双链 DNA 分子结合。 在 游离状态 下，SYBR Green I 发出 微弱的荧光 ，但 一旦与双链 DNA 结合 ， 嵌入至 dsDNA， 荧光大大增强 。

    因此， SYBR Green I 的荧光信号强度与双链 DNA 的数量相关， PCR 扩增不同时期中， dsDNA 含量不同， SYBR Green I 荧光信号强度不同。 可以根据荧光信号检测出 PCR 体系存在的双链 DNA 数量， 并可根据对照进行相关的计算和分析。

实验开始前，需准备好实验所需的各种试剂和耗材。

试剂包括：特异性 PCR 引物，新鲜提取备用的总 RNA。

使用的试剂盒有：用于合成 cDNA 第一链的罗氏试剂盒 Transcriptor FirstStrand cDNA Synthesis Kit，包含了 cDNA 反应所需要的所有实验组分以及相关的正对照反应组分。

配套 LightCycler® 480 使用的试剂盒 LightCycler® 480 SYBR Green I Master，包含了 PCR 所需的各种实验组分，如 1 号管中包含热启动 Taq DNA Polymerase及反应缓冲液， dNTP mix， SYBR Green I 染料和 MgCl2正式试验开始前，冰上解冻各个试剂及试剂盒组分，置于冰上待用。 注意：SYBR Green I Master 需避光放置。

所需仪器与耗材有：罗氏 LightCycler® 480 全自动实时定量 PCR 仪以及配套使用的 96 或 384 多孔板，透明封板膜等一次性耗材。赛默飞公司提供的 Thermo Scientific Arktik PCR 仪、单道移液器、 Nunc 冰盒及 QSP 盒装吸头等。

接下来进入实验部分，本实验操作流程是：首先用新鲜提取的 RNA 反转录合成 cDNA 第一链，然后进行实时荧光定量 PCR，其中包括： SYBR Green 反应体系的配置； PCR 程序设置； 运行 PCR 实验，样品编辑和结果分析。

首先是反转录合成 cDNA 第一链：

实验操作时注意：所有 RNA 相关的操作均要佩戴手套，防止 RNase 污染。相关操作严格按照试剂盒使用说明进行相关操作。

按照体系配方在冰上的 Rnase free 的灭菌 PCR 管中配置 Template primer mix，总体系 13μl，本实验是联合使用 anchored oligo dT 引物和随机六聚体引物进行的反转录。 先配置 NTC 对照，加入 9 号管水 10μl、 6 号管的 50mM oligo dT 引物 1μl、 5 号管的 0.6mM 随机六聚体引物 2μl，混匀。 然后进行样品一号管的体系配置， 依次加入 1μl 已调整浓度的总 RNA、 1μl oligo dT 引物、 2μl 随机六聚体引物、最后加 9μl 水补充至总体积 13μl，混匀。其他样品管，参照 1 号管的配置方法，依次加好反应体系。注意：可将总 RNA的模板量适当调整至 10ng-5μg，mRNA调整至 1-100ng。

若 RNA 样品浓度较低，则可加入 10μg/ml 的 MS2 RNA 来稳定模板 RNA。

将配好的反应 mix 在 PCR 仪中 65℃变性 10min，可有效减少 RNA 的二级结构。加热后迅速置于冰上骤冷，放置 5min。在反应 Template primer mix 中按体系配方顺序，依次加入以下试剂： 2 号管的 5×反转录酶 buffer， 4 号管 dNTP mix， 3 号管 40 U/μl 的 RNase 抑制剂， 1 号管 20 U/μl 的反转录酶，最终体积为 20μl。

若样品数较多，先配置反应 mix 再分装，小心吸打混合，切勿涡旋振荡。 混匀后于瞬时离心机上短暂离心，使样品和反应液落至离心管底部。将离心管放置 PCR 中，根据使用的引物以及目标 mRNA 的片段长度进行程序设置。本实验反应温度和时间设置为： 25℃， 10min， 55℃反应 30min。反应完毕后，于 85℃下加热 5min 灭活反转录酶， 再置于冰上停止反应。此反应产物可于 2-8℃存放 1-2h，或在-15 至-25℃下存放更长时间。

cDNA 产物无需进行纯化即可用于后续的 PCR 反应。 20μl 的 PCR 反应体系可取 2-5μl cDNA 反应产物进行扩增。此试剂盒中的反转录酶具有 RNase H 活性，可以在 cDNA 合成之后去除 RNA 模版，减少其对后续 PCR 的影响。

本部分实验，我们选用罗氏的 SYBR Green I Master 试剂盒进行基础的绝对定量分析。

本实验共设置 5 个标准样品，包含 1 个标记为 0 的空白对照， 5 个反转录样品，包含 NTC 对照，由于样品数较多，先配制不含模版的总体系，再分装为10管，加入各个样品的模板后，再将每个样品分装为 3 个复孔。

按照体系配方分别加入绿色盖子的 2×Master Mix， 10x Primer 上下游引物，PCR 级别水。 总体系配好后，在用移液枪轻柔吸打均匀，然后分装为 10 管，每管 55μl。往 10 管中分别加入各个样品对应的调整好浓度的 cDNA。STD 零加入 6μl 水代替模板，其余 STD 分别加入 6μl 已经逐级稀释好的标样模板。 反转录样品分别加入 6μl 浓度调整好的模板 DNA， 包含 NTC。混匀，然后将每个样按 20μl 每孔分装至 96 孔板中。用封孔膜盖好 96 孔板，将多孔板置于合适的离心机中 1500×g 配平离心 2min 将准备好的 96 孔板放置在LightCycler® 480 设备中。

双击打开 LightCycler® 480 的 1.5 软件并登陆，自动进入软件界面，点击 new experiment,在 Detection Format 选项中选择 SYBR Green I 模式, 点击 OK 完成检测通道的设定,接下来设置反应体积，对于 96 模块，反应体系为 10μl-100μl 之间，本实验是设定 20μl 的反应体系。

在 Program Name 中输入反应名称 pre incubation，预变性设定 1 个循环，无需进行荧光的收集，执行的温度和时间设定为 95℃ 10min，视图会根据设定进行实时的调整。

点击增加按钮，输入 Amplification，定义扩增循环的次数为 45 次，并选择荧光的收集功能 Quantification，然后设定 PCR 扩增循环的温度与时间为 95℃ 10s，点击增加按钮，设定退火温度和时间为 60℃ 10s，以上两步 Acquisition Mode 都默认选择 None，继续点击增加按钮，设置延伸温度和时间为 72℃ 20s，Acquisition Mode 选择 Single， Ramp Rate 均按自动调整值，无需再设置。

设置溶解曲线，在 Program 中的新的一行中输入 Melting Curves， 1 个循环数， Analysis Mode 选择 Melting Curves，时间和温度设置为 95℃ 5s， 点击增加按钮，新增设置温度和时间为 65℃ 1min，以上两步 Acquisition Mode 都默认选择 None。点击增加按钮，新增设置温度为 95℃，Acquisition Mode 选择 Continuous,其他设置无需改动。

设置保温的过程 Cooling，只需 1 个循环，无需收集荧光，设定温度和时间为 40℃、 1min。设置完成后点击右边的保存按钮保存设置的程序。此时整个 PCR的循环体系、温度的设置已经设定完毕。

点击 Start run 开始运行 PCR 反应，此时可在软件上实时监测样品扩增情况。

实验结束，点击 Sample Editor，进入样本编辑区。

Select Workflow 中选择 Abs Quant。根据样本在板中排布的方式进行样本编辑。设置阴性对照、空白对照、标准品以及未知样品等。

在 Select Sample 中，选中需要设置的样品孔。在下一栏中的 Sample Name 输入被选择样品组的名称，并在 Sample Type 中选择样品组的类型，最后点击 Make Replicates 设置复孔。标准品设置时，需填写拷贝数，只需填写好稀释倍数，初始浓度即可。 编辑好样品后，即可进行数据分析。如有需要，也可进行子集编辑。

样品编辑好后，可进行实验结果分析。

点击左边栏下方的 sum 按钮，相应出现实验的所有信息，包括：设计的反应程序，实验结果分析等。

点击 analysis，可以根据样品已有的数据进行细致准确地分析。

点击 Abs Quant second derivative max，弹出 create new analysis 窗口，在 Subset 选项中选择分析样品的分布区域，点击确定，即可出现分析图：相应样品的扩增曲线。

Standard Curve 是根据标准品得出的标准曲线，曲线左侧标有扩增效率、斜率、截距、线性关系、以及错误率。一般“Error”值越小，说明实验的准确率越高。

扩增效率如果越接近“2”，说明这次的扩增反应越好。

在数据表格，可显示单个样本的 Cp 值，以及相应的样本浓度值。

按复孔进行数据统计，显示 Cp 平均值，方差，浓度的平均值以及方差。

Ⅵ 一般的384孔板可以用于pcr吗

可以的。
一般384是用于real-time pcr的，不过普通的PCR也可以，就是……你不觉得贵吗

Ⅶ 生物学实验：各种孔板(6,24,96,384)都可以用于做什么实验

都可以用来培养细胞，384可以用来做高通量筛选，96空也可以用来做MTT,ELISA