配置pcr体系时需要加哪些

A. PCR体系怎么配

PCR Buffer50 mM KCl, 10 mMTris-HCl, 2.5 mMMgCl2, pH 8.3

200μM dNTPs指25ul体系中的dNTPs的终浓度。

0.2 μM invA primers,0.2 μM终浓度的配对链引物。

0.2μM sefA primers, 0.2 μM终浓度的自身链引物(下游引物)。

and 0.5 μM pefA primers

2.5U of Taq DNA polymerase，2.5U的Taq酶，一般Taq酶都是5U/ul的。

and 0.2μl of DNA template，0.2ul DNA模板。

剩余的体积用无菌水补足25ul。

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设计PCR 引物时的一般原则：

1、引物长度- 一般15~ 30碱基，过短则特异性低; 过长则会引起引物间的退火而影响有
效扩增。

2、 避免内部二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。

3、G/C 和A/T 碱基均匀分布，G/C 含量在45%~ 55% 之间，引物碱基序列尽可能选
择碱基随机分布，避免嘌呤、嘧啶的连续排列。

4、要避免两个引物间特别是3' 末端DNA 序列互补以及同一引物自身3' 末端的序列互
补，使它们不能形成引物二聚体或发卡结构。

5、引物3' 端碱基一般应与模板严格配对，并且3' 端为G、C 或T 时引发效率较高。

6、 引物5' 端碱基可不与模板匹配，可添加与模板无关的序列(如限制性内切酶的识别
位点、ATG 起始密码子或启动子序列等)。

B. 20微升pcr反应体系各种反应物分别应该加多少

10×扩增缓冲液2ul，4种dNTP混合物，各200umol/L 2ul，引物各10～100pmol 0.5ul，模板DNA 0.2ug，Taq DNA聚合酶0.2ul，Mg2+1.5mmol/L 1.5ul，加双或三蒸水至20ul。

PCR所用的酶主要有两种来源：Taq和Pfu，分别来自两种不同的噬热菌。其中Taq扩增效率高但易发生错配。Pfu扩增效率弱但有纠错功能。所以实际使用时根据需要必须做不同的选择。

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PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即：引物(PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。

DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。