比色算法

A. 【罗工流式宝典第12式】看似简单的CFSE增殖检测居然有这么多讲究

细胞增殖研究对于生物体生命特征的理解、细胞发育与分化的探索、疾病发病机制的解析以及临床治疗方法的安全性评估至关重要。传统的细胞增殖测定方法，如MTT/CCK8比色法、Br法和3H-TdR同位素掺入法，存在各自的局限性。比色法仅提供细胞总量变化的总体信息，无法在单细胞水平上分析细胞增殖情况；Br法仅能检测处于S期的细胞，适用于短期检测；同位素法存在放射性污染的风险。

相比之下，CFSE（羧基荧光素二乙酰基酯）染色方法及其数据分析方法具有显着优势，能够与流式细胞染色技术结合，在单细胞水平上检测细胞增殖，并进行动态分析。Flowjo等流式分析软件提供的增殖拟合算法，能够得到相对定量的分析结果，从而帮助人们更深入地了解细胞存活或死亡的机制。

CFSE染色的原理是：这种染料能够自由穿透细胞膜，一旦进入细胞，就会与胞内蛋白不可逆结合，并在细胞内被酯酶水解后释放出绿色荧光。在细胞分裂过程中，荧光会平均分配至两个子代细胞中，导致荧光强度随细胞分裂逐级递减。这一特性使得CFSE成为检测细胞增殖的有效工具。

CFSE标记的细胞在体内观察荧光可以保存长达数周，常用于活体细胞追踪检测实验和用荧光电镜观察细胞长期活动的实验，为细胞免疫和细胞生物学研究开辟了一条新的有效途径。

CFSE母液的制备需将干燥粉末溶于DMSO中，终浓度通常为5或10 mM，操作时需严格按说明书推荐进行。染料粉末可在≤-20°C下避光长期保存，使用DMSO溶解后建议分装保存，避免反复冻融，溶液在≤-20°C可稳定3个月。长时间存放会使CFSE的标记率下降。

CFSE染色体系包括细胞洗涤、离心收集、DPBS重悬、CFSE染色、37℃孵育、洗涤离心、含10%FBS的培养基洗涤、重悬于完全培养基、37℃培养、洗涤进行常规流式染色或直接上机操作。染色过程中使用的DPBS是为避免干扰细胞染色，相对PBS效果更佳。细胞染色浓度通常在0.5~50×10^6/ml，具体浓度取决于细胞浓度和抗性。CFSE浓度一般为0.5~5 μM，染色时间通常为3~5 min，染色时间对细胞活性和增殖基本无影响。

体外培养建议原代细胞培养时间在48~96 h之间，48 h后增殖峰开始相对明显，易于组间比较分析。CFSE荧光亮度会随细胞增殖分裂逐渐减弱，8-9代增殖后基本无法检测，因此建议不要超过96 h的培养时间。

数据分析方面，Flowjo软件提供了增殖数据拟合功能，可通过B站up主“半瓶流式小美腻”的指导进行操作。增殖结果图示包括未培养对照管、培养但未染色对照管、增殖细胞群体等，结合峰值和拟合结果或直接圈取增殖细胞群体进行组间对比。增殖峰的CV值反映了细胞标记率的差异，不同细胞亚群种类多的表现出相对较大的CV值，而肿瘤细胞等导致分配不对称程度增加时，无法根据传统拟合手法计算增殖代数，建议使用增殖区间细胞所占总细胞数的百分比进行组间比较。

实验过程中需注意对照设置，包括未培养但染色的对照细胞和培养但未染色的对照细胞，用于确认细胞的初始标记亮度和阴性信号及细胞的自发荧光。在细胞培养过程中，外界因素可能导致细胞生长状态下降，结合染死活染料排除死细胞干扰。