引物设计时终止密码子加在哪里

Ⅰ 起始密码子终止密码子,启动子,终止子,内含子,外显子在什么分子上

起始密码子和终止密码子在mRNA上，与翻译有关。
启动子和终止子分别在基因（DNA）的首端和尾端，与转录有关。
内含子和外显子在真核生物基因的编码区中，内含子没有编码蛋白质功能，外显子有编码蛋白质功能。

Ⅱ pcr引物设计的基本原则有哪些

PCR引物设计的11条黄金法则

1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。

2.引物长度一般在15~30碱基之间。 引物长度（primerlength）常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。

3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。 GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

4.引物3′端要避开密码子的第3位。 如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

5.引物3′端不能选择A，最好选择T。 引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。

6.碱基要随机分布。引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的列，否则容易导致错误引发（Falsepriming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。

7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Crossdimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。

8.引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。 △G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。应当选用5′端和中间△G值相对较高，而3′端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3′端的△G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。（不同位置的△G值可以用Oligo6软件进行分析）

9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。 引物的5′端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能。

10.扩增产物的单链不能形成二级结构。某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

11.引物应具有特异性。 引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。

Ⅲ 我们有一个质粒，他含有终止密码子，教授要我对其设计引物然后做PCR，并对PCR产物进行双酶切，但我不知道

在你PCR引物上正向和反向序列前各添加一个酶切位点（既然是双酶切那这两个酶应该不一样，同时注意移码的问题，且这两个酶切位点是你要用的载体上也存在的，而已扩增的目的片段里没有）。pcr后连T载体再酶切回收。同时用同样的酶对你的载体酶切并回收，再将两者相连。
你说到的去除终止密码子，应该是指的你的目的片段上的，你可以在设计引物的时候将基因的最后三个碱基去掉直接加酶切位点就可以将其去除了

Ⅳ 原核生物引物设计his标签设计原则

如果你的蛋白可以用亲和层析等非His tag的办法进行纯化，而且在原核里面表达后具备亲和层析的活性，就可以不用融合表达。但这时候你需要换载体或对原载体进行改造。因为N端的tag是必须带在你蛋白N端的（如果用pET32a的话）。当然N端的tag带上没坏处，就是需要买EK酶（有点贵）。还需要在纯化后再过一次柱子。
如果你不用后面的His标签，你需要在你的目的基因上加上终止密码子。
如果需要后面的His标签，你需要加2个核酸进行移框得到His，而非Pro.
3. 不用在引物上另外再加His标签了。