印记重编程
⑴ 比较胚胎分割动物与试管动物，核移植动物有何异同
胚胎发育过程是核质之间、细胞与细胞及细胞与胞外基质按严格的时空秩序相互作用的结果。从全能或多能胚胎干细胞分化为具有独特功能的体细胞，完全取决于基因在时间与地点上的选择性表达。对细胞分化和发育来说，最重要的不是个别基因的表达，而是整个基因网络在时间和空间上的紧密联系和配合。组成包括人体在内的高等动物机体的亿万个细胞，都是由一个受精卵发育而来的。像胚胎干细胞一样，分化了的体细胞仍然具有一整套完整的遗传信息。过去人们认为，细胞的分化程度越高，它指导早期胚胎发育成新个体的能力就越低，高度分化的体细胞甚至完全不具备这种能力。近几年体细胞动物克隆技术上取得的突破，不仅给人们的观念带来了很大的改变，而且由于它所蕴藏的商业和社会价值，在全世界引起了轰动。
1. 动物克隆的理论基础
在许多人眼里，体细胞克隆羊多莉 (Dolly) 的诞生是克隆技术的开始。其实不然。“克隆 (clone)”一词来源于希腊语，原意是用于扦插的枝条，也就是指无性繁殖。克隆在植物界的应用已有上千年的历史，理论上的突破则是本世纪的事。1902 年德国植物学家 Haberlandt指出，植物的体细胞具有母体全部的遗传信息，并具有发育成为完整个体的潜能，因而每个植物细胞都可像胚胎细胞那样，经离体培养再生成为完整植株。这就是所谓的细胞全能性。许多科学家为证实植物细胞的全能性作出了不懈的努力。1958 年，Steward成功地将一个胡萝卜细胞试管培养，长成了一株具有根、茎、叶等器官的完整植株。1964年Guha 和 Maheshwari利用毛叶曼陀罗的花药培育出单倍体植株。这样，植物细胞全能性获得了充分的论证。建立在此基础上的组织培养技术也得到迅速发展。
与植物细胞不同，在动物发育过程中分化了的细胞不能再产生完整的充分分化的个体。然而，动物胚胎的生长、分化和发育是否造成体细胞基因组的不可逆性修饰，即在发育过程中分化了的细胞是否具有与受精卵相同的核等价性 (nuclear equivalency) 或基因组连续性，一直是发育生物学要解决的问题。早在30 年代，着名的胚胎学家 Spemann 就已经提出“分化了的细胞核移入卵子中能否指导胚胎发育”这样的设想。用两栖类动物进行的一些克隆实验表明，早期胚胎细胞核经移植可产生成熟的动物个体，而从蝌蚪及成体动物细胞中取出的细胞核经移植生成的克隆动物最晚只能发育至蝌蚪期。胚胎分割及胚胎细胞核移植克隆动物已在许多物种中获得了成功。体细胞克隆绵羊[1]、小鼠[2,3]、牛[4,5] 及山羊[6]的成功，证明高度分化的细胞核仍具有全能性。
2. 体细胞克隆羊及小鼠实验成功分析
克隆羊Dolly 是世界上第一只由成体细胞通过无性过程产生的哺乳动物。在Dolly 诞生后的一年多时间里，全世界掀起了一股克隆热，并引起了一些激烈的争论和对Dolly身份的质疑。1998 年7 月出版的《Nature》报道两个独立的研究小组分别对Dolly 的血样、供体母羊冷冻组织及其细胞培养物进行卫星DNA 分析和DNA指纹分析，确认三者的一致性，证明Dolly 确实是体细胞克隆动物。在同期《Nature》上，美国夏威夷大学Wakayama 等人报道，由小鼠卵丘细胞 (cumulus cells) 克隆了27 只存活小鼠，其中7只是由克隆小鼠再次克隆的后代。
两栖类和哺乳类核移植实验发现，经核移植的卵母细胞不能正常发育的一个关键问题是供体核和受体卵母细胞之间的细胞周期不相容性。Wilmut 等的成功之处就在于他们找到了一种使供体核和受体卵母细胞更相容的方法。他们通过血清饥饿法使供体核细胞处于二倍体的G0 期，这样处理的供体核在DNA复制的时间上就与处于中期II的受体卵母细胞同步。从建立正确的染色体倍性 (ploidy) 这个角度来看，供体核处于G1 期也可以获得克隆动物。稳定表达b -半乳糖苷酶-新霉素基因的胎儿成纤维细胞作核供体，获得克隆牛证明了这一点[7]。
人们一般认为，供体核和卵母细胞组成的重组胚胎的发育过程与正常状况受精卵相仿。 羊胚胎基因组的转录一直到8～16个细胞才开始，这种转录时间的差异在理论上将允许胚胎有充裕的时间对植入的成体羊细胞核进行重新编程，使其进入胚胎发育期。由于不同的物种胚胎转录的起始时间各异，所以克隆的难易也不同。以往的研究发现，在小鼠的克隆过程中，基因组很早就被激活，移植的细胞核没有足够的时间进行重新编程。因此，许多研究者认为小鼠是最难克隆的动物之一。
Wakayama 等人的工作改变了这种观点。与Wilmut 等的方法相比，Wakayama 等采用了一种新的、相对简单的克隆技术。Dolly 是采用母羊的乳腺组织细胞经过“饥饿“ 培养，与去核的卵细胞进行电融合，促使融合细胞中遗传物质的重编程 (reprogramming), 然后逐步发育成胚胎。克隆小鼠采用核移植的方法，将自然状态下处于G0 期的卵丘细胞作核供体，直接注入去核的卵细胞。小鼠克隆过程中核移植后的重组胚胎放置0～6 小时后再激活，也有异于Wilmut 等用电刺激法同时融合重组胚胎和激活胚胎。Dolly 的产生过程中遗传物质的重编程和卵细胞的激活是电刺激法，而小鼠的克隆则采用在培养基中添加锶离子 (Sr2+) 和细胞松弛素B 的化学方法激活重组胚胎。
3. 动物克隆技术的应用
动物克隆近几年取得的一些突破性进展，为动物发育过程中基因表达的调控及发育生物学、遗传学等相关学科的发展必将产生深远的影响。虽然目前这种方法尚不成熟，但它已显示出诱人的应用前景。
动物克隆技术将首先应用于医药领域。利用体细胞供体经核移植生产转基因动物，可望降低生产成本。到目前为止，产生转基因动物的方法仍主要是1985 年Hammer 等建立的原核显微注射法。但是，这种方法只能使大约5％的动物携带外源基因。外源基因整合入动物基因组是个随机的过程，这导致外源基因在许多转基因动物系中的表达量不够高，而且因整合进生殖细胞的机率低而难以遗传给下一代。Schnieke 等发现，利用体细胞克隆技术生产含人凝血因子 IX 的转基因羊比原核显微注射法要有效得多[8]。其中，两者最显着的差异是体细胞克隆中的受体母羊全都携带外源基因，而原核显微注射法会产生许多不带外源基因的羊羔。这是由于，原核微注射法中所用胚胎在体外培养的时间较短，在此期间被检测为阳性的转基因可能会在以后的发育过程中丢失。用作核移植供体的细胞在体外培养的时间则较长，有较多的检测机会。另外，显微注射法制备的转基因动物的性别只有等到动物出生后才能得知, 而核移植可以通过鉴别核供体的核型而预先得知转基因动物的性别，可选择性地制备雌性的转基因动物, 有利于在母乳中表达外源基因。
克隆技术除了可以生产各种医用人体蛋白外，对人类的细胞和组织治疗也大有好处。利用克隆技术，可以用患者本人细胞培育出新组织，用来治疗糖尿病、帕金森氏症、神经损伤等多种疾病。用这种方法培育出的组织具有与患者正常组织完全相同的基因构成，因此不会产生免疫排斥反应。但是这些都涉及到克隆人这个敏感话题，目前克隆人在许多国家是法律禁止的。随着人类胚胎干细胞培养技术的完善，目前已有两家美国公司开始研究利用克隆技术培育人胚胎，希望大批量生产治疗疾病的干细胞。事实上，几年前人们就曾把人胎儿神经组织用来治疗帕金森氏症。考虑到伦理上的原因，人们也可以用克隆动物的胚胎干细胞作异源移植，以解决人类移植器官供求矛盾。
动物克隆技术还有助于加速动物育种的进程。利用优良动物品种的体细胞作核供体克隆动物，可以避免自然条件下选种所受到的动物生育周期和生育效率的限制，从而大大缩短育种年限，提高育种效率。动物克隆技术用于拯救濒危动物也受到广泛的关注。中国科学院动物研究所陈大元研究员提出用动物克隆技术拯救大熊猫的计划，在国内外均引起一定的反响。
4. 动物克隆技术的不足及未来发展方向
动物克隆技术虽然取得了一定的进展，在生物医药领域也得到了初步应用。但是，该技术目前还很不完善。存活率低是当今核移植技术的最大缺陷。它突出表现为：孕期流产率高，围产期死亡率高，新生儿体重较重及产生后对环境的适应性较差。以成体细胞核作核供体问题更为严重。最近，Shiels 等报道克隆羊的端粒较同年羊短[9]。Renard 等报道，体细胞核移植可能影响克隆动物免疫系统的正常发育[10]。他们用胚胎细胞克隆牛的耳细胞通过核移植克隆出一头牛。牛犊看起来很健康，但出生一个半月后，它体内的淋巴细胞和红血球急剧减少，不久就死于贫血。尸体解剖发现，该牛犊脾脏、胸腺和淋巴结等淋巴组织都没有得到正常发育。
导致动物克隆存活率低和异常发育的原因很多，缺乏基础理论支撑是其中之一。动物克隆技术的不断完善，还需要分子遗传学、细胞学、发育生物学等相关基础学科的进一步研究和发展。迄今为止，人们虽然在动物克隆过程中已经积累了不少数据，但一些很基本的问题仍亟需解决。
基因组重新编程的机制尚不清楚。人们虽然观测到核移植后细胞核的激活与早期胚胎原核发育类似，但较详细的信息仍不甚明了。其中，成熟促进因子(maturation promoting factor，MPF)、核膜破裂(nuclear envelope breakdown，NEBD) 和早熟染色体凝集 (premature chromosome condensation, PCC) 在基因组重编过程中的作用还需明确。
基因印记 (imprinting) 对核移植后基因组重新编程的影响。基因印记现象在哺乳动物的发育过程中普遍存在，它是指基因的表达与否取决于它们是在父源染色体上还是母源染色体上。有些印记基因只从母源染色体上表达，而有些则只从父源染色体上表达。基因印记与动物克隆技术的成功及不足有何关系值得深入研究。
动物克隆种属及细胞差异的原因。克隆不同种属的动物难易有别，其中的原因目前人们还不清楚。目前可以用作体细胞核移植核供体的细胞类型还较少。Wakayama 等用处于 G0/G1期的卵丘细胞克隆得到小鼠，而他们采用处于G0 期的足细胞 、神经细胞作核供体进行的克隆实验均未获得成活个体，这显示供体核处于G0 期并非保证胚胎发育的充分条件。Dominko等发现去核的牛卵细胞能使来自羊、猴、鼠、猪等不同种属的细胞核激活，并在体外发育为相应的胚胎，但目前还没有一个可继续发育为完整的动物个体。如果这项工作能成功，将十分有利于濒危动物的保护。
动物克隆技术条件的优化还没有解决。如核供体和卵细胞的选材、核质比的选择、重组胚胎的激活方式、是否需要作连续核移植等。
综上所述，动物克隆研究已在理论基础、技术优化及实际应用等方面取得很大的进展。但该技术目前还很不完善，相关理论研究还很薄弱，人们要提高动物克隆的成功率还需不懈的努力。另外，克隆动物与正常胚胎的发育有何异同，也值得深入研究。这些问题的解决，将有助于加深人们对动物胚胎发育过程中分子机制的认识。
⑵ 多利是怎样诞生的
【动物克隆的理论基础】
在许多人眼里，体细胞克隆羊多利(Dolly)的诞生是克隆技术的开始。其实不然。“克隆(clone)”一词来源于希腊语，原意是用于扦插的枝条，也就是指无性繁殖。克隆在植物界的应用已有上千年的历史，理论上的突破则是本世纪的事。1902年德国植物学家Haberlandt指出，植物的体细胞具有母体全部的遗传信息，并具有发育成为完整个体的潜能，因而每个植物细胞都可像胚胎细胞那样，经离体培养再生成为完整植株。这就是所谓的细胞全能性。许多科学家为证实植物细胞的全能性作出了不懈的努力。1958年，Steward成功地将一个胡萝卜细胞试管培养，长成了一株具有根、茎、叶等器官的完整植株。1964年Guha和Maheshwari利用毛叶曼陀罗的花药培育出单倍体植株。这样，植物细胞全能性获得了充分的论证。建立在此基础上的组织培养技术也得到迅速发展。
与植物细胞不同，在动物发育过程中分化了的细胞不能再产生完整的充分分化的个体。然而，动物胚胎的生长、分化和发育是否造成体细胞基因组的不可逆性修饰，即在发育过程中分化了的细胞是否具有与受精卵相同的核等价性(nuclear equivalency)或基因组连续性，一直是发育生物学要解决的问题。早在30年代，着名的胚胎学家Spemann就已经提出“分化了的细胞核移人卵子中能否指导胚胎发育”这样的设想。用两栖类动物进行的一些克隆实验表明，早期胚胎细胞核经移植可产生成熟的动物个体，而从蝌蚪及成体动物细胞中取出的细胞核经移植生成的克隆动物最晚只能发育至蝌蚪期。胚胎分割及胚胎细胞核移植克隆动物已在许多物种中获得了成功。体细胞克隆绵羊、小鼠，牛及山羊的成功，证明高度分化的细胞核仍具有全能性。
【体细胞克隆羊及小鼠实验成功分析】
克隆羊多利是世界上第一只由成体细胞通过无性过程产生的哺乳动物。在多利诞生后的一年多时间里，全世界掀起了一股克隆热，并引起了一些激烈的争论和对多利身份的质疑。1998年7月出版的《自然》报道两个独立的研究小组分别对多利的血样、供体母羊冷冻组织及其细胞培养物进行卫星DNA分析和DNA指纹分析，确认三者的一致性，证明多利确实是体细胞克隆动物。在同期《自然》上，美国夏威夷大学Wakayama等人报道，由小鼠卵丘细胞(cumulus cells)克隆了27只存活小鼠，其中7只是由克隆小鼠再次克隆的后代。
两栖类和哺乳类核移植实验发现，经核移植的卵母细胞不能正常发育的一个关键问题是供体核和受体卵母细胞之间的细胞周期的不相容性。Wilmut等的成功之处就在于他们找到了一种使供体核和受体卵母细胞更相容的方法。他们通过血清饥饿法使供体核细胞处于二倍体的Go期，这样处理的供体核在DNA复制的时间上就与处于中期Ⅱ的受体卵母细胞同步。从建立正确的染色体倍性(ploidy)这个角度来看，供体核处于G1期也可以获得克隆动物。稳定表达半乳糖苷酶一新霉素基因的胎儿成纤维细胞作核供体，获得克隆牛证明了这一点。
人们一般认为，供体核和卵母细胞组成的重组胚胎的发育过程与正常状况受精卵相仿。羊胚胎基因组的转录一直到8～16个细胞才开始，这种转录时间的差异在理论上将允许胚胎有充裕的时间对植入的成体羊细胞核进行重新编程，使其进入胚胎发育期。由于不同的物种胚胎转录的起始时间各异，所以克隆的难易也不同。以往的研究发现，在小鼠的克隆过程中，基因组很早就被激活，移植的细胞核没有足够的时间进行重新编程。因此，许多研究者tk)gd,鼠是最难克隆的动物之一。
Wakayama等人的工作改变了这种观点。与Wilmut等的方法相比，Wakayama等采用了一种新的、相对简单的克隆技术。多利是采用母羊的乳腺组织细胞经过“饥饿”培养，与去核的卵细胞进行电融合，促使融合细胞中遗传物质的重编程(reprogramming)，然后逐步发育成胚胎。克隆小鼠采用核移植的方法，将自然状态下处于G0期的卯丘细胞作核供体，直接注入去核的卵细胞。小鼠克隆过程中核移植后的重组胚胎放置O～6小时后再激活，也有异于Wilmut等用电刺激法同时融合重组胚胎和激活胚胎。多利的产生过程中遗传物质的重编程和卵细胞的激活是电刺激法，而小鼠的克隆则采用在培养基中添加锶离T-(Sr2+)和细胞松弛素B的化学方法激活重组胚胎。
【动物克隆技术的应用】
动物克隆近几年取得的一些突破性进展，为动物发育过程中基因表达的调控及发育生物学、遗传学等相关学科的发展必将产生深远的影响。虽然目前这种方法尚不成熟，但它已显示出诱人的应用前景。
动物克隆技术将首先应用于医药领域。利用体细胞供体经核移植生产转基因动物，可望降低生产成本。到目前为止，产生转基因动物的方法仍主要是1985年Hammer等建立的原核显微注射法。但是，这种方法只能使大约5％的动物携带外源基因。外源基因整合入动物基因组是个随机的过程，这导致外源基因在许
多转基因动物系中的表达量不够高，而且因整合进生殖细胞的机率低而难以遗传给下一代。Schnieke等发现，利用体细胞克隆技术生产含人凝血因子IX的转基因羊比原核显微注射法要有效得多。其中，两者最显着的差异是体细胞克隆中的受体母羊全都携带外源基因，而原核显微注射法会产生许多不带外源基因的羊羔。这是由于，原核显微注射法中所用胚胎在体外培养的时间较短，在此期间被检测为阳性的转基因可能会在以后的发育过程中丢失。用作核移植供体的细胞在体外培养的时间则较长，有较多的检测机会。另外，显微注射法制备的转基因动物的性别只有等到动物出生后才能得知，而核移植可以通过鉴别核供体的核型而预先得知转基因动物的性别，可选择性地制备雌性的转基因动物，有利于在母乳中表达外源基因。
克隆技术除了可以生产各种医用人体蛋白外，对人类的细胞和组织治疗也大有好处。利用克隆技术，可以用患者本人细胞培育出新组织，用来治疗糖尿病、帕金森氏症、神经损伤等多种疾病。用这种方法培育出的组织具有与患者正常组织完全相同的基因构成，因此不会产生免疫排斥反应。但是这些都涉及到克隆人这个敏感话题，目前克隆人在许多国家是法律禁止的。随着人类胚胎干细胞培养技术的完善，目前已有两家美国公司开始研究利用克隆技术培育人胚胎，希望大批量生产治疗疾病的干细胞。事实上，几年前人们就曾把人胎儿神经组织用来治疗帕金森氏症。考虑到伦理上的原因，人们也可以用克隆动物的胚胎干细胞作异源移植，以解决人类移植器官供求矛盾。
动物克隆技术还有助于加速动物育种的进程。利用优良动物品种的体细胞作核供体克隆动物，可以避免自然条件下选种所受到的动物生育周期和生育效率的限制，从而大大缩短育种年限，提高育种效率。动物克隆技术用于拯救濒危动物也受到广泛的关注。中国科学院动物研究所陈大元研究员提出用动物克隆技术拯救大熊猫的计划，在国内外均引起一定的反响。
【动物克隆技术的不足及未来发展方向】
动物克隆技术虽然取得了一定的进展，在生物医药领域也得NT初步应用。但是，该技术目前还很不完善。存活率低是当今核移植技术的最大缺陷。它突出表现为：孕期流产率高，围产期死亡率高，新生儿体重较重及产生后对环境的适应性较差。以成体细胞核作核供体问题更为严重。最近，Shiels等报道克隆羊的端粒较同年羊短。Renard等报道，体细胞核移植可能影响克隆动物免疫系统的正常发育。他们用胚胎细胞克隆牛的耳细胞通过核移植克隆出一头牛。牛犊看起来很健康，但出生一个半月后，它体内的淋巴细胞和红血球急剧减少，不久就死于贫血。尸体解剖发现，该牛犊脾脏、胸腺和淋巴结等淋巴组织都没有得到正常发育。
导致动物克隆存活率低和异常发育的原因很多，缺乏基础理论支撑是其中之一。动物克隆技术的不断完善，还需要分子遗传学、细胞学、发育生物学等相关基础学科的进一步研究和发展。迄今为止，人们虽然在动物克隆过程中已经积累了不少数据，但一些很基本的问题仍亟需解决。
基因组重新编程的机制尚不清楚。人们虽然观测到核移植后细胞核的激活与早期胚胎原核发育类似，但较详细的信息仍不甚明了。其中，成熟促进因子(maturation promoting factor，MPF)、核膜破裂(nuclear envelope breakdown，NEBD)和早熟染色体凝集(premature chromosome condensation，PCC)在基因组重编过程中的作用还需明确。
基因印记(imprinting)对核移植后基因组重新编程的影响。基因印记现象在哺乳动物的发育过程中普遍存在，它是指基因的表达与否取7央．于它们是在父源染色体上还是母源染色体上。有些基因印记只从母源染色体上表达，而有些则只从父源染色体上表达。基因印记与动物克隆技术的成功及不足有何关系值得深入研究。
动物克隆种属及细胞差异的原因。克隆不同种属的动物难易有别，其中的原因目前人们还不清楚。目前可以用作体细胞核移植核供体的细胞类型还较少。Wakayama等用处于Go／G1期的卵丘细胞克隆得到小鼠，而他们采用处于Go期的足细胞、神经细胞作核供体进行的克隆实验均未获得成活个体，这显示核供体处于Go期并非保证胚胎发育的充分条件。Dominko等发现去核的牛卵细胞能使来自羊、猴、鼠、猪等不同种属的细胞核激活，并在体外发育为相应的胚胎，但目前还没有一个可继续发育为完整的动物个体。如果这项工作能成功，将十分有利于濒危动物的保护。
动物克隆技术条件的优化还没有解决。如核供体和卵细胞的选材、核质比的选择、重组胚胎的激活方式、是否需要作连续核移植等。
【谈谈动物克隆】
首先，何谓克隆。克隆是由klone一词音译过来的，又叫无性繁殖，也就是不需两性配子结合即可产生后代的繁殖方式，与无性繁殖相对的则是有性繁殖，高等动物和我们人类的传宗接代都属于有性繁殖，是生物进化到高级阶段的一种表现。让我们用一个具体的例子说明什么是无性繁殖?我们学校离江边很近，如果您在江边散步，会发现岸边泥土中插着很多柳条，您随意在那支柳条上折一截，再插在泥土里，过不了多久，您扦插的柳条又可发芽并长成～棵小树。这是一个非常典型的无性繁殖的例子。这样的例子在我们身边很多，《西游记》中孙悟空抓几根猴毛一吹，变成几只小猴子，这也是克隆。
1997年英国罗斯林研究所的资深科学家IanWilmut及其合作者向全世界宣布他们成功地以分化的成年母羊乳腺细胞为核供体，克隆出一只绵羊，取名多利(Dolly)这一研究结果推翻了长期以来一直认为分化的动物细胞不具备发育全能性的观点。该研究成果被列入1997年世界十大研究成果之首。这里需要解释的另一概念是细胞的全能性，简单地说全能性就是一个细胞可发育成一个个体，植物细胞具有全能性是公认的，但植物细胞具有全能性也是有条件的，举一个简单的例子，我们可以从某一株植物的嫩芽组织培养出新的植株，但我们不能从枯死的叶子中培养出一个新的植株。
其次，介绍一下克隆的过程。克隆动物有提供核即遗传物质的一方，称核供体，此外还需来自母畜一方的卵母细胞，卵母细胞最外层是一圈在光学显微镜下呈透明状的结构，称透明带，透明带内层是一层很薄的膜，称卵黄膜，卵黄膜内包着卵黄，卵黄是胚胎发育早期的营养物质，卵黄膜与透明带之间有一定的空隙，称卵周隙。克隆时可以将核供体置人卵周隙，也可将核供体直接置人细胞质内，即卵黄当中，之后采用电脉冲或化学物质刺激使核供体与卵母细胞融合，成为合子(Zygote)，随即合子开始卵裂，一分为二，二分为四，当卵裂到一定程度，即当卵裂的细胞(卵裂球，Blastermere)达到一定数目后，卵裂球中间形成一个空腔，这时候的胚胎被称之为囊胚(Blastocyst)，之后囊胚将被送人代孕母畜的子宫，一直到出生，这样出生的动物即克隆动物。这中间的问题是成功率非常低，就拿“多利”来说，当时科学家将277个经过上述过程获得的克隆胚胎送入代孕母羊的子宫，只得到一只“多利”，大家可以算一算成功的概率是多少。
第三，克隆动物的意义。“多利”的问世在世界范围内引起很大的震动；这项研究成果不仅在理论上具有重大突破，而且有非常广阔的应用前景，突出地表现在拯救濒危动物品种，甚至可以使一些灭绝的动物再世。举个例子来说，我们国家的大熊猫近年来由于植被被破坏，数目锐减，以至成为一种濒危动物。我国科学家从大熊猫身上获取细胞，并与兔卵母细胞融合，融合胚胎在体外发育到囊胚，值得一提的是，大熊猫的体重虽说是兔子体重的上百倍，但刚出生的大熊猫与刚出生的兔子体重十分接近，这种克隆与上面所介绍的克隆有所不同，这种克隆被称之为异种克隆。通过这种克隆生出的大熊猫是什么样子，现在尚无法估计，可以确定的是和正常出生的大熊猫会有所不同，因为兔子卯母细胞的细胞质中含有大量的线粒体，线粒体中的基因是编码蛋白质的，这些基因极有可能影响到大熊猫的毛色，也就是说通过这种方法出生的大熊猫可能是灰色的。
最后谈谈克隆动物出现的问题。2003年2月14日世界首例体细胞克隆绵羊寿终正寝，带给人类很多思考，这只羊仅活了6岁，而正常羊的寿命应为12～13岁。这只羊是从一只6岁母羊的乳腺细胞中克隆出来的，问题的焦点就在于克隆出来的个体不仅继承了原来的性状，也继承了原来的年龄。如果这一结论成立，这就大大地削弱克隆技术的应用价值。不久前许多媒体报道首例克隆人在以色列出生，如果上述结论成立，则可以得出这样一个结论，那就是出生的婴儿无论得到多么无微不至的照顾也将是短命的?研究者发现克隆绵羊染色体的端粒比正常羊短20％，而众所周知端粒是决定动物一生中细胞分裂次数的主要因素。
【动物基因工程良种与克隆技术】
(1)动物转基因育种技术。
自从1982年美国科学家Palmiter等将大鼠生长激素基因用微注射(microin—jection)方法转移到小鼠的卵原核(pronuclei)，获得了个体比普通小鼠大一倍多的超级鼠(Supermouse)~，充分揭示了基因转移技术运用于畜禽和鱼类育种工作的巨大潜力。由此，该技术得到了世界各国的高度重视，并激发人们把目标转向家畜、家禽和鱼类的转基因研究，并成功获得了转基因猪、牛、羊、鸡、兔和鱼等的“超级动物”。
(2)动物克隆技术。
动物克隆技术包括动物胚胎细胞克隆技术和动物体细胞克隆技术。就目前研究水平而言，两者成功机率相差很大，利用胚胎细胞克隆可能要比体细胞克隆容易一些。截至目前，全世界应用胚胎细胞克隆技术几乎成功地克隆了所有家畜，并获得了后代，而用体细胞克隆成功的报道只有羊、猴数例。从生产利用角度看，虽然运用胚胎细胞克隆与体细胞克隆技术在创造动物新品种方面都具有广阔的前景，但当前动物胚胎细胞克隆技术比较成熟，应用于畜牧业生产由一枚优良畜种胚胎重组数以千计的同基因优良种畜，在实现动物无性繁殖和胚胎生产工厂化方面具有极为重要的应用价值。
【世界首匹克隆马诞生，母马生下“自己”】
意大利克雷莫纳市繁殖技术与家畜饲养实验室6日证实，世界上第一匹克隆马已于今年5月28日在意大利诞生，这也是世界上首例哺乳动物生下它自己的克隆体。
实验室的克隆马科研小组负责人切萨雷·加利教授接受新华社记者电话采访时说，他的研究小组克隆出的雌性小马被取名为“普罗梅泰亚”。这匹小马自然顺产，出生时体重36公斤，属正常范围。加利说，母马和小马身体状况都很好，尤其是小马活泼健壮，喜好运动，平时喝母奶或吃干草饲料，现在其体重已经增至约100公斤。据介绍，克隆马计划从去年初开始进行，前后共耗资15万欧元。7日出版的英国《自然》杂志还将详细介绍这一成果。
加利是意大利知名的动物克隆专家。他曾在1999年9月克隆出公牛“加俐略”，此前还在1996年参与培育了世界上第一只体细胞克隆动物——克隆羊“多利”。在这次研究中，他们采用了母马的表皮细胞，将其细胞核注入除去细胞核的卵细胞内。研究人员总共用了800多个卵细胞，其中有22个发育成7天大的胚胎，但最后只有“普罗梅泰亚”成功诞生。
检测表明，小马“普罗梅泰亚”的DNA与其生母几乎完全相同。加利进一步解释说，用于克隆小马、培植胚胎的表皮细胞就是由生下小马的母马提供的，是世界上首次由哺乳动物生下它自己的克隆体。也就是说，“普罗梅泰亚”相当于它生母的同卵双胞胎。
加利说，与以前使用过的克隆方法相比，这次在克隆马过程中所采用的方法更容易、更实用。科研人员希望利用新技术克隆出的动物能够对疯牛病等具有免疫力，还希望这项研究能帮助人们克隆赛马和其他良种马。
曾于2001年在世界上首次克隆出濒危野生动物欧洲盘羊的意大利科学家帕斯夸利里诺·洛伊说，克隆小马的诞生在国际上是一项“了不起的成就”，在研究中所应用的技术将有助于挽救濒临灭绝的稀有马种。意大利卫生部长杰罗拉莫·西尔基也说，这是意大利科学界“一个巨大的成功”。
⑶ 李世杰的主持课题
1、转基因生物新品种培育重大专项课题“高通量基因克隆技术体系的研究” 子课题（2011-2015，项目编号2011ZX08009-002）”
2、国家自然科学基金“体细胞克隆牛Dlk1-Gtl2印记区域表观遗传重编程的研究” （2010-2012 ，项目编号30972098）
3、农业部转基因重大专项“慢病毒介导及基因敲出动物转基因关键技术研究”子课题（2009-2011，项目编号2009ZX0801024B）
4、863项目“家畜卵泡高效诱导发育技术研究与应用”子课题（2008-2010，项目编号2008AA101003）
5、河北省自然科学基金项目“H19基因在正常繁殖牛以及体外受精牛中的印记状态分析”（2006-2008，项目编号C2006001032）
⑷ 小学五年级的克隆资料
什么是克隆
克隆是英语单词clone的音译，clone源于希腊文klon，原意是指幼苗或嫩枝，以无性繁殖或营养繁殖的方式培育植物，如杆插和嫁接。
如今，克隆是指生物体通过体细胞进行的无性繁殖，以及由无性繁殖形成的基因型完全相同的后代个体组成的种群。克隆也可以理解为复制、拷贝，就是从原型中产生出同样的复制品，它的外表及遗传基因与原型完全相同。
1997年 2月，绵羊“多利”诞生的消息披露，立即引起全世界的关注，这头由英国生物学家通过克隆技术培育的克隆绵羊，意味着人类可以利用动物身上的一个体细胞，产生出与这个动物完全相同的生命体，打破了千古不变的自然规律。
如何评价克隆技术？
无论“雷里安”如何狡辩、美化自己的行为，世界许多着名科学家的看法十分相近：“雷里安”进行克隆人实验没有任何科学目的，一句话，并非为了科学进步。
不少科学家认为，在评论克隆人这个事件时，重要的是应该先弄清楚：人类到底需不需要克隆人？
莫斯科谢琴诺夫医学院遗传学教研室阿利?阿萨诺夫教授评论道，技术和工艺方面的可能性大大超过了我们对“人类需要什么”的理解。
克隆人赞同者的论据是，该技术能够帮助不孕者拥有自己的后代。
实际上，这个要求可以通过其它更安全更有效的途径来满足。因此可以断定，利用克隆技术进行传宗接代只是借口，克隆人实验背后隐藏着非科学的商业目的。
阿萨诺夫教授认为，眼下，克隆人没有任何前景，也没有任何意义。值得指出的是，现在没有人能够预言克隆人会产生什么后果，因此现在进行克隆人实验是不道德的。
修理病变器官是克隆的未来
阿萨诺夫教授说，俄罗斯科学界坚信，克隆技术的未来应该是在内科疗法中的应用，即“内科疗法克隆”。不过，现存的问题是，该术语在表达上还极其不准确。
从本质上讲，“内科疗法克隆”是建立移植细胞材料的方法，在意义上与现在所指的克隆没有共同之处，它是一种能够培养健康器官的细胞工艺技术，利用该技术可以部分或全部替换病变器官。
根据阿萨诺夫教授的解释，现在科学家刚刚触及到人体体内所发生的内部过程这个问题，只略知皮毛。科学家前不久解读了人类基因图谱，但还不能很好地应用所得到的知识来揭开人体奥秘。为此，科学家还要进行若干年的深入研究，才能完善并掌握克隆技术。
现在的克隆，百分之九十九将是丑八怪
阿萨诺夫教授说，俄罗斯科学家已经不止一次发出警告，克隆试验所得的产物99％是丑八怪。
他们的例证为：着名的克隆羊多利是经过300次失败后才获得的。遗憾的是，多利并不是一只健康的小羊，它患有关节炎等疾病，而且出现早衰病征。另外，在其它所有克隆动物身上都发现了各种发育畸形。包括阿萨诺夫教授在内的俄罗斯科学家认为，在这种情况下进行克隆人实验，至少是一种极不负责任的做法。克隆人的一生将是一场噩梦，到30岁时，他们将成为苍老之人。
什么东西可以科隆
应该说有生命的都可以克隆
现在已经克隆什么
蛙: 1962年，未成功
鲤鱼: 1963年，中国科学家童第周早在1963年就通过将一只雄性鲤鱼DNA插入来自雌性鲤鱼的卵成功克隆了一只雌性鲤鱼，比多利羊的克隆早了33年。但由于相关论文是发表在一本中文科学期刊，并没有翻译成英文，所以并不为国际上所知晓。（源自：PBS)
绵羊: 1996年，多利（Dolly）
猕猴: 2000年1月，Tetra，雌性
猪: 2000年3月，5只苏格兰PPL小猪；8月，Xena，雌性
牛: 2001年，Alpha和Beta，雄性
猫: 2001年底，CopyCat（CC），雌性
小鼠: 2002年
兔: 2003年3-4月分别在法国和朝鲜独立地实现；
骡: 2003年5月，爱达荷Gem，雄性；6月，犹他先锋，雄性
鹿: 2003年，Dewey
马: 2003年，Prometea，雌性
狗: 2005年，韩国首尔大学实验队，史纳比
尽管克隆研究取得了很大进展，目前克隆的成功率还是相当低的：多利出生之前研究人员经历了276次失败的尝试；70只小牛的出生则是在9000次尝试后才获得成功，并且其中的三分之一在幼年时就死了；Prometea 也是花费了328次尝试才成功出生。 而对于某些物种，例如猫和猩猩，目前还没有成功克隆的报道。而狗的克隆实验，也是经过数百次反复试验再得来的成果。
多利出生后的年龄检测表明其出生的时候就上了年纪。她6岁的时候就得了一般老年时才得的关节炎。这样的衰老被认为是端粒的磨损造成的。端粒是染色体位于末端的。随着细胞分裂，端粒在复制过程中不断磨损，这通常认为是衰老的一个原因。然而，研究人员在克隆成功牛后却发现它们实际上更年轻。分析它们的端粒表明它们不仅是回到了出生的长度，而且比一般出生时候的端粒更长。这意味着它们可以比一般的牛有更长的寿命，但是由于过度生长，它们中的很多都过早夭折了。研究人员相信相关的研究最终可以用来改变人类的寿命。
克隆人
由于伦理和现实上可能的后果，克隆人一直是一个充满争议的话题。许多人认为克隆人的尝试是不道德的，但有些科学家公开宣称尝试克隆人。一些团体声称他们正在进行克隆人研究或者已经克隆出了人，但是没有独立的消息来源证实。
⑸ 核移植的实际应用
美国器官移植专家
细胞治疗 定义细胞移植可以治疗由于细胞功能缺陷所引起的各种疾病，如糖尿病；中枢神经系统疾病（帕金森，阿尔莫茨症）；肝功能衰竭；甲状腺疾病。
异种器官移植
治疗性克隆是利用核移植技术将病人的体细胞核移植到去核的卵母细胞中，使其重编程并发育成囊胚，然后再用胚胎干细胞分离技术从克隆囊胚的ICM分离出多能胚胎干细胞（ES）。这种干细胞在遗传学上和病人完全一致，再定向诱导其分化成病人所需要的体细胞进行移植，以取代和修复患者已丧失功能的细胞、组织或器官，而达到完全治愈。治疗性克隆不仅解决移植物与受者间的免疫排斥反应问题，而且可以解决移植物的来源问题。
核移植科普图
1997年底，英国Roslin研究所和PPL公司通过克隆转基因体细胞，获得了6只整合neo或neo和F2IX基因绵羊，这标志着核移植介导的转基因技术成功问世。2000年，英国PPL公司将人AAT基因定点整合到胎儿成纤维细胞的α1原胶原（Procollagen）基因座位，而后用转基因细胞进行核移植，生产出世界首例基因打靶绵羊，其乳中AAT蛋白含量达到了650mg/L，远高显微注射法18mg/L的水平。2004年，台湾培育带有治疗血友病的“第八凝血因子”的体细胞克隆羊。2005年，这只克隆羊产下一只同样带有第八凝血因子的公羊。虽然核移植技术有着广阔的应用前景，并且已取得了一些进展如体细胞核移植等，但也存在着一些问题。主要包括核移植效率低，动物畸形。这要求研究人员进一步了解核质作用机理，改进培养方式。
到2007年为止，虽然核移植技术的发展较快，然而该技术还存在许多问题，如核移植成功率普遍比较低、重构胚的发育率低、畸形胚的比率高。体外培养的时间过长或培养液的成份可能导致移植胚的流产以及出生后的仔畜很快死亡。基因重组编程的机制尚不清楚，其中MPF、NEBD（核膜破裂）和PCC在基因组重编过程的作用还需阐明。基因印记对核移植重新编程的影响以及基因印记与动物克隆技术的成功及不足有何关系，还不清楚。
2001年我国科学家将牛耳细胞克隆的胚胎移入135头牛体内，每头牛移植了两枚克隆胚胎。从2002年1月8日起，陆续获取了14头克隆牛犊。至2003年11月，这批被克隆的牛，存活的只有5头。
体细胞核移植技术在畜牧业、医药卫生，以及其它领域拥有着广泛的应用前景。
⑹ 速度,我要克隆资料,要的就是你的速度.
胚胎发育过程是核质之间、细胞与细胞及细胞与胞外基质按严格的时空秩序相互作用的结果。从全能或多能胚胎干细胞分化为具有独特功能的体细胞，完全取决于基因在时间与地点上的选择性表达。对细胞分化和发育来说，最重要的不是个别基因的表达，而是整个基因网络在时间和空间上的紧密联系和配合。组成包括人体在内的高等动物机体的亿万个细胞，都是由一个受精卵发育而来的。像胚胎干细胞一样，分化了的体细胞仍然具有一整套完整的遗传信息。过去人们认为，细胞的分化程度越高，它指导早期胚胎发育成新个体的能力就越低，高度分化的体细胞甚至完全不具备这种能力。近几年体细胞动物克隆技术上取得的突破，不仅给人们的观念带来了很大的改变，而且由于它所蕴藏的商业和社会价值，在全世界引起了轰动。
克隆技术在现代生物学中被称为“生物放大技术”，它已经历了三个发展时期：第一个时期是微生物克隆，即用一个细菌很快复制出成千上万个和它一模一样的细菌，而变成一个细菌群；第二个时期是生物技术克隆，比如用遗传基因――DNA克隆；第三个时期是动物克隆，即由一个细胞克隆成一个动物。克隆绵羊“多利”由一头母羊的体细胞克隆而来，使用的便是动物克隆技术。
在自然界，有不少植物具有先天的克隆本能，如番薯、马铃薯、玫瑰等的插枝繁殖的植物。而动物的克隆技术，则经历了由胚胎细胞到体细胞的发展过程
1. 人类进行克隆的历史
公元前5000年·谷物选种
人类祖先发现，最茁壮的植株的种子培植出的谷物也更优良。这是人类开始按照人的意图控制生命的开端，这也是克隆技术最终目标的最初体现。
1952年·克隆蝌蚪
小小的蝌蚪改写了生物技术发展史，成为世界上第一种被克隆的动物。美国科学家罗伯特·布里格斯和托玛斯·金用一只蝌蚪的细胞创造了与原版完全一样的复制品。
1972年·基因复制
克隆技术精细到以单个基因复制为单位。科学家将某种特定基因单离出来，将它与某有机体(最初是一种酵母)结合，有机体将新基因融入自己的DNA结构后再繁殖，产生出理想基因的复制品。
1978年·第一例试管婴儿出生
整个世界吵嚷着想要目睹人类第一个体外受精婴儿路易斯的“庐山真面目”。英国医生用丈夫的精子在一个试管内使卵子受精，然后将胚胎植入健康母亲的子宫内。
1997年·多利，你好！
1996年，世界第一例从成年动物细胞克隆出的哺乳动物绵羊多利诞生。这个秘密直到1997年2月才向世人公布。苏格兰胚胎学家伊恩·威尔姆特和同事用一只成年母羊乳房内取出的细胞克隆出多利。
1998年·克隆批量化
美国夏威夷大学的科学家用成年细胞克隆出50多只老鼠，并接着培育出3代遗传特征完全一致的实验鼠。与此同时，其它几个私立研究机构也用不同的方法成功克隆出小牛。其中最引人注目的是，日本人用一个成年母牛的细胞培育出8只遗传特征完全一样的小牛，成功率高达80%。
2000年·人类近亲被克隆
美国俄勒冈的研究者用与克隆多利羊截然不同的方法克隆出猴子，科学家将一个仅包含8个细胞的早期胚胎分裂为4份，再将它们分别培育出新胚胎，惟一成活的只有Tetra。与多利不同的是，tetra既有母亲也有父亲，但它只是人工4胞胎中的一个。此外，帮助培育出多利羊的生物技术公司宣布克隆出5只小猪仔。该公司宣称，克隆猪终将成为人类移植器官的“加工厂”。
2001年·克隆人？
3月，美国生殖科学家帕纳伊奥提斯·扎沃斯和一个国际研究小组宣布，数百对夫妇已自愿报名参加培育克隆婴孩的实验。该小组宣称最早至2003年便可帮助不孕夫妇培育克隆婴儿。1月，英国成为全球第一个有效地使克隆人类胚胎合法化的国家。政府通过一项富争议性的法案，目的在于允许对人类胚胎内的根细胞进行科学实验。该法案要求克隆体必须在诞生后14日内被毁灭。培育克隆婴儿仍属非法行
2. 动物克隆的理论基础
在许多人眼里，体细胞克隆羊多莉 (Dolly) 的诞生是克隆技术的开始。其实不然。“克隆 (clone)”一词来源于希腊语，原意是用于扦插的枝条，也就是指无性繁殖。克隆在植物界的应用已有上千年的历史，理论上的突破则是本世纪的事。1902 年德国植物学家 Haberlandt指出，植物的体细胞具有母体全部的遗传信息，并具有发育成为完整个体的潜能，因而每个植物细胞都可像胚胎细胞那样，经离体培养再生成为完整植株。这就是所谓的细胞全能性。许多科学家为证实植物细胞的全能性作出了不懈的努力。1958 年，Steward成功地将一个胡萝卜细胞试管培养，长成了一株具有根、茎、叶等器官的完整植株。1964年Guha 和 Maheshwari利用毛叶曼陀罗的花药培育出单倍体植株。这样，植物细胞全能性获得了充分的论证。建立在此基础上的组织培养技术也得到迅速发展。
与植物细胞不同，在动物发育过程中分化了的细胞不能再产生完整的充分分化的个体。然而，动物胚胎的生长、分化和发育是否造成体细胞基因组的不可逆性修饰，即在发育过程中分化了的细胞是否具有与受精卵相同的核等价性 (nuclear equivalency) 或基因组连续性，一直是发育生物学要解决的问题。早在30 年代，着名的胚胎学家 Spemann 就已经提出“分化了的细胞核移入卵子中能否指导胚胎发育”这样的设想。用两栖类动物进行的一些克隆实验表明，早期胚胎细胞核经移植可产生成熟的动物个体，而从蝌蚪及成体动物细胞中取出的细胞核经移植生成的克隆动物最晚只能发育至蝌蚪期。胚胎分割及胚胎细胞核移植克隆动物已在许多物种中获得了成功。体细胞克隆绵羊、小鼠、牛 及山羊的成功，证明高度分化的细胞核仍具有全能性。
3. 体细胞克隆羊及小鼠实验成功分析
克隆羊Dolly 是世界上第一只由成体细胞通过无性过程产生的哺乳动物。
1996年7月里的一天，对英国爱丁堡罗斯林（Roslin）研究所由伊恩·维尔穆特（I. Wilmut）领导的科学研究小组全体成员来讲，是一个令人激动的日子。对全世界来说，也是值得庆贺的一天。因为在这一天，一只妊娠了148天，体重为6.6千克, 编号为6LL3的小羊来到了这个世界。这只羊的身世与众不同，它既无父亲，又无母亲，它是科学家们用克隆技术复制出来的一只小绵羊。经过几个月的精心呵护，这只身世不凡的小绵羊茁壮成长，并获得了一个动听的名字——多莉（Dolly）。
1997年2月23日，伊恩. 维尔穆特科学研究小组向全世界宣布了他们的研究结果，英国的“自然”杂志（Nature）于1997年2月27日全文刊登了他们的实验结果。这一消息立刻轰动了全世界。各国的报刊，电台，电视台等媒体对此结果纷纷进行了报道和评述。科学家和大学教授也纷纷被邀请到各种媒体讲解，评论“多莉”的身世和它的出生对科学研究、经济发展和社会进步的影响。许多国家的政府官员也纷纷发表讲话，明令不准将“多莉”克隆技术用于人类。由于各种媒体的大量传播，一个新的名词已为广大民众所逐渐知晓的“克隆”。
早在20世纪50年代，美国的科学家以两栖动物和鱼类作研究对象，首创了细胞核移植技术。1986年，英国科学家魏拉德森用胚胎细胞克隆出一只羊，以后又有人相继克隆出牛、鼠、兔、猴等动物。这些克隆动物的诞生，均是利用胚胎细胞作为供体细胞进行细胞核移植而获得成功的。
而克隆绵羊“多利”是用乳腺上皮细胞（体细胞）作为供体细胞进行细胞核移植的，它翻开了生物克隆史上崭新的一页，突破了利用胚胎细胞进行核移植的传统方式，使克隆技术有了长足的进展。
克隆绵羊“多利”没有父亲，多莉”的产生与三只母羊有关；一只是怀孕三个月的芬兰多塞特母绵羊，两只是苏格兰黑面母绵羊。芬兰多塞特母绵羊提供了全套遗传信息，即提供了细胞核（称之为供体）；一只苏格兰黑面母绵羊提供无细胞核的卵细胞；另一只苏格兰黑面母绵羊提供羊胚胎的发育环境—子宫，是“多莉”羊的“生”母。其整个克隆过程简述如下：
1、从芬兰多塞特母绵羊的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的营养培养液中，细胞逐渐停止了分裂，此细胞称之为供体细胞；
2、从一头苏格兰黑面母绵羊的卵巢中取出未受精的卵细胞，并立即将其细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为受体细胞；
3、利用电脉冲的方法，使供体细胞和受体细胞发生融合，最后形成了融合细胞，由于电脉冲还可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能象受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成胚胎细胞；
4、将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成一只小绵羊。
出生的“多莉”小绵羊与多塞特母绵羊具有完全相同的外貌。“多莉”出生后生长正常，并于1997年底与一头威尔士高山羊自然交配怀孕。在1998年4月13日凌晨4时生下了一只雌性的体重为2.7千克的小羊羔，取名为“邦妮（Bonnie）”。这说明生世不凡的“多莉”具有正常的生育能力。随着“多莉”的诞生，不同的实验室也宣称成功地克隆出了猪、猴和牛等，他们所用的生物材料也都是体细胞。
无性繁殖现象在低等植物中是存在的，而按照哺乳动物界的规律，动物的繁衍要由两性生殖细胞来完成，由于父体和母体的遗传物质在后代体内各占一半，因此后代绝对不是父母的复制品。而克隆绵羊的诞生，意味着人类可以利用哺乳动物的一个细胞大量生产出完全相同的生命体，完全打破了亘古不变的自然规律。这是生物工程技术发展史中的一个里程碑，也是人类历史上的一项重大科学突破。
在Dolly 诞生后的一年多时间里，全世界掀起了一股克隆热，并引起了一些激烈的争论和对Dolly身份的质疑。1998 年7 月出版的《Nature》报道两个独立的研究小组分别对Dolly 的血样、供体母羊冷冻组织及其细胞培养物进行卫星DNA 分析和DNA指纹分析，确认三者的一致性，证明Dolly 确实是体细胞克隆动物。在同期《Nature》上，美国夏威夷大学Wakayama 等人报道，由小鼠卵丘细胞 (cumulus cells) 克隆了27 只存活小鼠，其中7只是由克隆小鼠再次克隆的后代。
两栖类和哺乳类核移植实验发现，经核移植的卵母细胞不能正常发育的一个关键问题是供体核和受体卵母细胞之间的细胞周期不相容性。Wilmut 等的成功之处就在于他们找到了一种使供体核和受体卵母细胞更相容的方法。他们通过血清饥饿法使供体核细胞处于二倍体的G0 期，这样处理的供体核在DNA复制的时间上就与处于中期II的受体卵母细胞同步。从建立正确的染色体倍性 (ploidy) 这个角度来看，供体核处于G1 期也可以获得克隆动物。稳定表达b -半乳糖苷酶-新霉素基因的胎儿成纤维细胞作核供体，获得克隆牛证明了这一点。
人们一般认为，供体核和卵母细胞组成的重组胚胎的发育过程与正常状况受精卵相仿。 羊胚胎基因组的转录一直到8～16个细胞才开始，这种转录时间的差异在理论上将允许胚胎有充裕的时间对植入的成体羊细胞核进行重新编程，使其进入胚胎发育期。由于不同的物种胚胎转录的起始时间各异，所以克隆的难易也不同。以往的研究发现，在小鼠的克隆过程中，基因组很早就被激活，移植的细胞核没有足够的时间进行重新编程。因此，许多研究者认为小鼠是最难克隆的动物之一。
Wakayama 等人的工作改变了这种观点。与Wilmut 等的方法相比，Wakayama 等采用了一种新的、相对简单的克隆技术。Dolly 是采用母羊的乳腺组织细胞经过“饥饿“ 培养，与去核的卵细胞进行电融合，促使融合细胞中遗传物质的重编程 (reprogramming), 然后逐步发育成胚胎。克隆小鼠采用核移植的方法，将自然状态下处于G0 期的卵丘细胞作核供体，直接注入去核的卵细胞。小鼠克隆过程中核移植后的重组胚胎放置0～6 小时后再激活，也有异于Wilmut 等用电刺激法同时融合重组胚胎和激活胚胎。Dolly 的产生过程中遗传物质的重编程和卵细胞的激活是电刺激法，而小鼠的克隆则采用在培养基中添加锶离子 (Sr2+) 和细胞松弛素B 的化学方法激活重组胚胎。
4. 动物克隆技术的应用
动物克隆近几年取得的一些突破性进展，为动物发育过程中基因表达的调控及发育生物学、遗传学等相关学科的发展必将产生深远的影响。虽然目前这种方法尚不成熟，但它已显示出诱人的应用前景。
动物克隆技术将首先应用于医药领域。利用体细胞供体经核移植生产转基因动物，可望降低生产成本。到目前为止，产生转基因动物的方法仍主要是1985 年Hammer 等建立的原核显微注射法。但是，这种方法只能使大约5％的动物携带外源基因。外源基因整合入动物基因组是个随机的过程，这导致外源基因在许多转基因动物系中的表达量不够高，而且因整合进生殖细胞的机率低而难以遗传给下一代。Schnieke 等发现，利用体细胞克隆技术生产含人凝血因子 IX 的转基因羊比原核显微注射法要有效得多[8]。其中，两者最显着的差异是体细胞克隆中的受体母羊全都携带外源基因，而原核显微注射法会产生许多不带外源基因的羊羔。这是由于，原核微注射法中所用胚胎在体外培养的时间较短，在此期间被检测为阳性的转基因可能会在以后的发育过程中丢失。用作核移植供体的细胞在体外培养的时间则较长，有较多的检测机会。另外，显微注射法制备的转基因动物的性别只有等到动物出生后才能得知, 而核移植可以通过鉴别核供体的核型而预先得知转基因动物的性别，可选择性地制备雌性的转基因动物, 有利于在母乳中表达外源基因。
克隆技术除了可以生产各种医用人体蛋白外，对人类的细胞和组织治疗也大有好处。利用克隆技术，可以用患者本人细胞培育出新组织，用来治疗糖尿病、帕金森氏症、神经损伤等多种疾病。用这种方法培育出的组织具有与患者正常组织完全相同的基因构成，因此不会产生免疫排斥反应。但是这些都涉及到克隆人这个敏感话题，目前克隆人在许多国家是法律禁止的。随着人类胚胎干细胞培养技术的完善，目前已有两家美国公司开始研究利用克隆技术培育人胚胎，希望大批量生产治疗疾病的干细胞。事实上，几年前人们就曾把人胎儿神经组织用来治疗帕金森氏症。考虑到伦理上的原因，人们也可以用克隆动物的胚胎干细胞作异源移植，以解决人类移植器官供求矛盾。
动物克隆技术还有助于加速动物育种的进程。利用优良动物品种的体细胞作核供体克隆动物，可以避免自然条件下选种所受到的动物生育周期和生育效率的限制，从而大大缩短育种年限，提高育种效率。动物克隆技术用于拯救濒危动物也受到广泛的关注。中国科学院动物研究所陈大元研究员提出用动物克隆技术拯救大熊猫的计划，在国内外均引起一定的反响。
5. 动物克隆技术的不足及未来发展方向
动物克隆技术虽然取得了一定的进展，在生物医药领域也得到了初步应用。但是，该技术目前还很不完善。存活率低是当今核移植技术的最大缺陷。它突出表现为：孕期流产率高，围产期死亡率高，新生儿体重较重及产生后对环境的适应性较差。以成体细胞核作核供体问题更为严重。最近，Shiels 等报道克隆羊的端粒较同年羊短。
Renard 等报道，体细胞核移植可能影响克隆动物免疫系统的正常发育。他们用胚胎细胞克隆牛的耳细胞通过核移植克隆出一头牛。牛犊看起来很健康，但出生一个半月后，它体内的淋巴细胞和红血球急剧减少，不久就死于贫血。尸体解剖发现，该牛犊脾脏、胸腺和淋巴结等淋巴组织都没有得到正常发育。
导致动物克隆存活率低和异常发育的原因很多，缺乏基础理论支撑是其中之一。动物克隆技术的不断完善，还需要分子遗传学、细胞学、发育生物学等相关基础学科的进一步研究和发展。迄今为止，人们虽然在动物克隆过程中已经积累了不少数据，但一些很基本的问题仍亟需解决。
基因组重新编程的机制尚不清楚。人们虽然观测到核移植后细胞核的激活与早期胚胎原核发育类似，但较详细的信息仍不甚明了。其中，成熟促进因子(maturation promoting factor，MPF)、核膜破裂(nuclear envelope breakdown，NEBD) 和早熟染色体凝集 (premature chromosome condensation, PCC) 在基因组重编过程中的作用还需明确。
基因印记 (imprinting) 对核移植后基因组重新编程的影响。基因印记现象在哺乳动物的发育过程中普遍存在，它是指基因的表达与否取决于它们是在父源染色体上还是母源染色体上。有些印记基因只从母源染色体上表达，而有些则只从父源染色体上表达。基因印记与动物克隆技术的成功及不足有何关系值得深入研究。
动物克隆种属及细胞差异的原因。克隆不同种属的动物难易有别，其中的原因目前人们还不清楚。目前可以用作体细胞核移植核供体的细胞类型还较少。Wakayama 等用处于 G0/G1期的卵丘细胞克隆得到小鼠，而他们采用处于G0 期的足细胞 、神经细胞作核供体进行的克隆实验均未获得成活个体，这显示供体核处于G0 期并非保证胚胎发育的充分条件。Dominko等发现去核的牛卵细胞能使来自羊、猴、鼠、猪等不同种属的细胞核激活，并在体外发育为相应的胚胎，但目前还没有一个可继续发育为完整的动物个体。如果这项工作能成功，将十分有利于濒危动物的保护。
动物克隆技术条件的优化还没有解决。如核供体和卵细胞的选材、核质比的选择、重组胚胎的激活方式、是否需要作连续核移植等。
克隆技术被誉为“一座挖掘不尽的金矿”，它在生产实践上具有重要的意义，潜在的经济价值十分巨大。首先，在动物杂种优势利用方面，较常规方法而言，哺乳动物克隆技术费时少、选育的种畜性状稳定；其次，克隆技术在抢救濒危珍稀物种、保护生物多样性方面可发挥重要作用，即使在自然交配成功率很低的情况下，科研人员也可以从濒危珍稀动物个体身上选择适当的体细胞进行无性繁殖，达到有效保护这些物种的目的。
动物克隆技术的重大突破，也带来了广泛的争议。克隆技术对人类来说，是一把“双刃剑”。一方面，它能给人类带来许多益处――诸如保持优良品种、挽救濒危动物、利用克隆动物相同的基因背景进行生物医学研究等；另一方面，它将对生物多样性提出挑战――生物多样性是自然进化的结果，也是进化的动力，有性繁殖是形成生物多样性的重要基础，而“克隆动物”则会导致生物品系减少，个体生存能力下降。
更让人不寒而栗的是，克隆技术一旦被滥用于克隆人类自身，将不可避免地失去控制，带来空前的生态混乱，并引发一系列严重的伦理道德冲突。世界各国政府和科学界已对此高度关注，采取立法等措施明令禁止用克隆技术制造“克隆人”，以保证克隆只用于造福人类，而绝非复制人类。
综上所述，动物克隆研究已在理论基础、技术优化及实际应用等方面取得很大的进展。但该技术目前还很不完善，相关理论研究还很薄弱，人们要提高动物克隆的成功率还需不懈的努力。另外，克隆动物与正常胚胎的发育有何异同，也值得深入研究。这些问题的解决，将有助于加深人们对动物胚胎发育过程中分子机制的认识。
⑺ 简化甲基化测序和甲基化测序的区别
什么是DNA甲基化？
简单来说，DNA甲基化就是在DNA甲基化转移酶(DNMT)的作用下将甲基选择性地添加到胞嘧啶上形成5′-甲基胞嘧啶的过程。DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育和肿瘤发生发展中起着重要作用，是目前及未来很长一段时间的研究热点之一。
DNA甲基化测序
随着高通量测序技术的发展，我们能够从全基因组水平来分析5’-甲基胞嘧啶及组蛋白修饰等事件，发现很多基因组学研究发现不了的东西，这就是 “DNA甲基化测序”！且近年来测序成本的不断下降及测序技术的迭代更新，DNA甲基化测序方法可选择性更多了。
目前表观遗传学DNA甲基化研究测序方法常见的有：全基因组重亚硫酸盐甲基化测序[WGBS]、精准DNA甲基化和羟甲基化测序[oxBS-seq]、优化版简化甲基化测序[RRBS/dRRBS/XRBS]、单/微量细胞全基因组甲基化测序[scWGBS]、扩增子（羟）甲基化测序、（羟）甲基化DNA免疫共沉淀测序[(h)MeDIP-seq]等6种，适用于不同DNA甲基化研究方向的解决方案。
（1）全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）
全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）可以在全基因组范围内精确的检测所有单个胞嘧啶碱基（C碱基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金标准。WGBS能为基因组DNA甲基化时空特异性修饰的研究提供重要技术支持，能广泛应用在个体发育、衰老和疾病等生命过程的机制研究中，也是各物种甲基化图谱研究的首选方法。
常规全基因组甲基化测序技术通过T4-DNA连接酶，在超声波打断基因组DNA片段的两端连接接头序列，连接产物通过重亚硫酸盐处理将未甲基化修饰的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U，进而通过接头序列介导的 PCR 技术将尿嘧啶U转变为胸腺嘧啶T。
技术优势：
l 应用范围广：适用于人和大多数动植物研究（参考基因组已知）
l 全基因组覆盖：最大限度地获取完整的全基因组甲基化信息，精确绘制甲基化图谱
l 单碱基分辨率：可精确分析每一个C碱基的甲基化状态
研究案例：
Whole-Genome Bisulfite Sequencing of Two Distinct Interconvertible DNA Methylomes of Mouse Embryonic Stem Cells. 两种状态的小鼠胚胎干细胞的甲基化组学研究
① 背景
小鼠胚胎干细胞一般生长在含有血清的基质中，被称作血清干细胞(serum ESCs)；加两种激酶抑制因子使胚胎干细胞在无血清的情况下更能保持多能性的基态，这种干细胞称为2i干细胞(2i ESCs)；这两种状态的胚胎干细胞可以互相转化。以前这方面的甲基化研究大多基于质谱，覆盖度和研究结果有限，尚缺乏2i胚胎干细胞的甲基化组学研究。
② 方法
利用全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS），对这两种可互相转换的小鼠胚胎干细胞进行甲基化组学研究
③ 结论
全面准确的检测了两种小鼠胚胎干细胞的DNA甲基化修饰并进行了系统的比较；同serum ESCs相比，雄性2iESCs全局低甲基化；在血清中，雌性ESCs跟雄性2i ESCs类似呈现全局低甲基化，而在2i ESCs状态下，甲基化水平会进一步降低。
（2）精准DNA甲基化和羟甲基化测序（oxBS-seq）
DNA羟甲基化是近年发现的一种新的DNA修饰并迅速成为研究热点。随着研究的深入，发现之前被认为是检测DNA甲基化“金标准”的重亚硫酸盐测序并不能区分DNA甲基化（5mC）和DNA羟甲基化（5hmC）。易基因联合剑桥大学建立了化学氧化法结合重亚硫酸盐转化的测序技术（oxidative bisulfite sequencing, oxBS-Seq），该技术不仅可以精确检测DNA甲基化，排除DNA羟甲基化的影响，还可以双文库结合同时单碱基分辨率精确检测DNA羟甲基化。
技术原理：
oxBS-Seq将5hmC氧化5fC，后者可以被Bisulfite转为U，从而实现5mC的精准检测；同时，经过与常规Bisulfite结果比较可以实现对5hmC的准确检测。
技术优势：
l DNA甲基化检测全新的“金标准”
l 全基因组单碱基检测DNA羟甲基化修饰
l 多重标准验证高氧化效率和高Bisulfite转换率
l 实验偏好性低，重复性高（R²>0.98）
l 可满足多种测序应用需求：简化基因组氧化甲基化测序（oxRRBS），目标区域氧化甲基化测序（Target-oxBS）
研究案例：
Quantitative sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at single-base resolution （oxBS 技术单碱基检测5mC和5hmC在鼠胚胎干细胞中的水平）
① 背景
随着5hmC在哺乳动物基因组中的发现，传统的bisulfite测序已不能精确区分5mC和5hmC的修饰差异，传统BS的测序结果中，5mC的修饰水平实际是5mC和5hmC两者信号的合集，建立一种精确区分两者的实验技术迫在眉睫。
② 方法
利用oxBS测序技术对小鼠胚胎干细胞DNA甲基化和羟甲基化进行检测和定量。
③ 结论
本研究首次建立了通过化学氧化结合重亚硫酸盐处理的实验技术。该技术首先将5hmC氧化为5fC，进而可被重亚硫酸盐转换成U，从而排除了5hmC对5mC的信号干扰，达到精确检测基因组5mC的目的。运用该技术对小鼠胚胎干细胞的研究发现，5hmC在CGI相关的转录调控区域和LINE1元件中含量较高，表明其对表观重编程可能起到重要作用。
（3）简化甲基化测序（RRBS/dRRBS/XRBS）
简化甲基化测序(Reced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)是利用限制性内切酶对基因组进行酶切，富集启动子及CpG岛等重要的表观调控区域并进行重亚硫酸盐测序。该技术显着提高了高CpG区域的测序深度，在CpG岛、启动子区域和增强子元件区域可以获得高精度的分辨率，是一种准确、高效、经济的DNA甲基化研究方法，在大规模临床样本的研究中具有广泛的应用前景。为了适应科研技术的需要，我们进一步开发了可在更大区域内捕获CpG位点的双酶切RRBS(dRRBS)，可研究更广泛区域的甲基化，包括CGI shore等区域。
为助力低样本量多维度分析，我们开发了富集覆盖CpG岛、启动子、增强子、CTCF结合位点的甲基化靶向测序方法：extend-ed-representation bisulfite sequencing（XRBS），实现了高灵敏度和样本复用，使其具有高度可扩展性，并适用于有限的样本和单个细胞。
技术优势：
l 精确度高：在其覆盖范围内可达到单碱基分辨率。
l 重复性好：多样本的覆盖区域重复性可达到85%-95%，适用于多样本间的差异分析。
l 性价比高：测序区域针对高CpG区域，数据利用率更高。
研究案例：
DNA Methyltransferase Inhibition Reverses Epigenetically Embedded Phenotypes in Lung Cancer Preferentially Affecting Polycomb Target Genes DNA甲基化的改变对癌症细胞侵袭能力的影响
① 背景
癌细胞的表型在一定程度上由表观决定，比如DNA甲基化。癌症发展后期的转移特性可能与表观遗传修饰的改变有关。
② 方法
利用RRBS技术检测具有高侵袭性的非小细胞肺癌细胞系(A549和HTB56)以及相应经过甲基化抑制剂氮杂胞苷（azacytidine）处理过的细胞系的甲基化修饰。探讨甲基化的改变对肺癌细胞系的侵袭能力的影响。
③ 结论
高侵袭性细胞系在发展过程中，DNA甲基化修饰发生了广泛的改变。同低侵袭能力的细胞系相比，RRBS检测到的CpG富集的区域中有2.5%的区域发生了差异修饰。当使用了DNA甲基化抑制剂azacytidine，伴随着这些高甲基化修饰的位点出现甲基化修饰的丢失，细胞系的侵袭能力也发生了逆转。
5-Azacytidine诱导的侵袭能力逆转
（4）单/微量细胞全基因组甲基化测序（scWGBS）
单细胞及微量样本的DNA甲基化组学研究很大程度上受制于建库测序技术。传统的文库构建方法或类似于基因组DNA的单细胞扩增技术很难应用到甲基化实验过程中。易基因建立了基于线性扩增和单管建库的技术，可充分降低文库偏好性，准确的完成珍贵样本的全基因组甲基化研究。
单细胞及微量珍稀样本的甲基化研究主要应用于肿瘤发生机制，癌症研究，胚胎植入前诊断，胚胎早期发育，生殖细胞重组，干细胞及细胞异质性等研究领域。应用的样本包括单细胞、微量细胞等。
技术优势：
l 超低起始量：单细胞或超低的建库DNA起始量
l 测序覆盖度高 ：最大限度地获取完整的全基因组甲基化信息，精确绘制甲基化图谱
l 单碱基分辨率：可精确分析每一个C碱基的甲基化状态
研究案例：
Single-cell DNA methylome sequencing of human preimplantation embryos. 人类植入前胚胎发育的单细胞DNA甲基化组图谱
① 背景
在哺乳动物基因组上，胞嘧啶（主要是CpG二连体中的胞嘧啶）在DNA甲基化酶的催化下会发生甲基化。研究显示，DNA甲基化对多个生物学过程都至关重要，如基因表达抑制、转座子转录活性调节、X染色体的失活，以及基因组印记的维持等。此前研究显示在着床前的早期胚胎发育过程中只有大规模的DNA去甲基化。而此次研究数据显示，精子和卵细胞结合受精之后，在人类早期胚胎大规模DNA去甲基化的同时，也在大量高度特异的DNA从头加甲基化，这表明在人类早期胚胎第一轮DNA甲基化组重编程过程中，全局的DNA去甲基化‘净结果’实际上是高度有序的大规模DNA去甲基化和局部DNA加甲基化两种分子过程相互拮抗产生的动态平衡的结果。
② 方法
利用单细胞DNA甲基化组高通量测序方法，首次在单细胞分辨率对人类植入前胚胎发育过程进行了更加深入的分析。
③ 结论
在这篇文章中，为了进一步在单细胞水平研究DNA甲基化重编程过程的动态特征，利用单细胞全基因组DNA甲基化组高通量测序技术，对人类植入前胚胎发育的各个关键阶段进行了单细胞、单碱基分辨率的系统研究，主要发现有：（a）首次发现了人类植入前胚胎发育过程中存在大量特异性的DNA从头加甲基。（b）首次发现从二细胞胚胎阶段开始父母本基因组上的剩余甲基化水平发生逆转，在同一个单细胞中母本基因组上的剩余甲基化水平显着高于父本基因组上的剩余甲基化水平。（c）首次发现DNA甲基化在早期胚胎卵裂过程中的不对称分配可以用来追溯同一个胚胎中每个细胞的遗传谱系。内容来源：易基因科技
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胚胎发育过程是核质之间、细胞与细胞及细胞与胞外基质按严格的时空秩序相互作用的结果。从全能或多能胚胎干细胞分化为具有独特功能的体细胞，完全取决于基因在时间与地点上的选择性表达。对细胞分化和发育来说，最重要的不是个别基因的表达，而是整个基因网络在时间和空间上的紧密联系和配合。组成包括人体在内的高等动物机体的亿万个细胞，都是由一个受精卵发育而来的。像胚胎干细胞一样，分化了的体细胞仍然具有一整套完整的遗传信息。过去人们认为，细胞的分化程度越高，它指导早期胚胎发育成新个体的能力就越低，高度分化的体细胞甚至完全不具备这种能力。近几年体细胞动物克隆技术上取得的突破，不仅给人们的观念带来了很大的改变，而且由于它所蕴藏的商业和社会价值，在全世界引起了轰动。
克隆技术在现代生物学中被称为“生物放大技术”，它已经历了三个发展时期：第一个时期是微生物克隆，即用一个细菌很快复制出成千上万个和它一模一样的细菌，而变成一个细菌群；第二个时期是生物技术克隆，比如用遗传基因――DNA克隆；第三个时期是动物克隆，即由一个细胞克隆成一个动物。克隆绵羊“多利”由一头母羊的体细胞克隆而来，使用的便是动物克隆技术。
在自然界，有不少植物具有先天的克隆本能，如番薯、马铃薯、玫瑰等的插枝繁殖的植物。而动物的克隆技术，则经历了由胚胎细胞到体细胞的发展过程
1. 人类进行克隆的历史
公元前5000年·谷物选种
人类祖先发现，最茁壮的植株的种子培植出的谷物也更优良。这是人类开始按照人的意图控制生命的开端，这也是克隆技术最终目标的最初体现。
1952年·克隆蝌蚪
小小的蝌蚪改写了生物技术发展史，成为世界上第一种被克隆的动物。美国科学家罗伯特·布里格斯和托玛斯·金用一只蝌蚪的细胞创造了与原版完全一样的复制品。
1972年·基因复制
克隆技术精细到以单个基因复制为单位。科学家将某种特定基因单离出来，将它与某有机体(最初是一种酵母)结合，有机体将新基因融入自己的DNA结构后再繁殖，产生出理想基因的复制品。
1978年·第一例试管婴儿出生
整个世界吵嚷着想要目睹人类第一个体外受精婴儿路易斯的“庐山真面目”。英国医生用丈夫的精子在一个试管内使卵子受精，然后将胚胎植入健康母亲的子宫内。
1997年·多利，你好！
1996年，世界第一例从成年动物细胞克隆出的哺乳动物绵羊多利诞生。这个秘密直到1997年2月才向世人公布。苏格兰胚胎学家伊恩·威尔姆特和同事用一只成年母羊乳房内取出的细胞克隆出多利。
1998年·克隆批量化
美国夏威夷大学的科学家用成年细胞克隆出50多只老鼠，并接着培育出3代遗传特征完全一致的实验鼠。与此同时，其它几个私立研究机构也用不同的方法成功克隆出小牛。其中最引人注目的是，日本人用一个成年母牛的细胞培育出8只遗传特征完全一样的小牛，成功率高达80%。
2000年·人类近亲被克隆
美国俄勒冈的研究者用与克隆多利羊截然不同的方法克隆出猴子，科学家将一个仅包含8个细胞的早期胚胎分裂为4份，再将它们分别培育出新胚胎，惟一成活的只有Tetra。与多利不同的是，tetra既有母亲也有父亲，但它只是人工4胞胎中的一个。此外，帮助培育出多利羊的生物技术公司宣布克隆出5只小猪仔。该公司宣称，克隆猪终将成为人类移植器官的“加工厂”。
2001年·克隆人？
3月，美国生殖科学家帕纳伊奥提斯·扎沃斯和一个国际研究小组宣布，数百对夫妇已自愿报名参加培育克隆婴孩的实验。该小组宣称最早至2003年便可帮助不孕夫妇培育克隆婴儿。1月，英国成为全球第一个有效地使克隆人类胚胎合法化的国家。政府通过一项富争议性的法案，目的在于允许对人类胚胎内的根细胞进行科学实验。该法案要求克隆体必须在诞生后14日内被毁灭。培育克隆婴儿仍属非法行
2. 动物克隆的理论基础
在许多人眼里，体细胞克隆羊多莉 (Dolly) 的诞生是克隆技术的开始。其实不然。“克隆 (clone)”一词来源于希腊语，原意是用于扦插的枝条，也就是指无性繁殖。克隆在植物界的应用已有上千年的历史，理论上的突破则是本世纪的事。1902 年德国植物学家 Haberlandt指出，植物的体细胞具有母体全部的遗传信息，并具有发育成为完整个体的潜能，因而每个植物细胞都可像胚胎细胞那样，经离体培养再生成为完整植株。这就是所谓的细胞全能性。许多科学家为证实植物细胞的全能性作出了不懈的努力。1958 年，Steward成功地将一个胡萝卜细胞试管培养，长成了一株具有根、茎、叶等器官的完整植株。1964年Guha 和 Maheshwari利用毛叶曼陀罗的花药培育出单倍体植株。这样，植物细胞全能性获得了充分的论证。建立在此基础上的组织培养技术也得到迅速发展。
与植物细胞不同，在动物发育过程中分化了的细胞不能再产生完整的充分分化的个体。然而，动物胚胎的生长、分化和发育是否造成体细胞基因组的不可逆性修饰，即在发育过程中分化了的细胞是否具有与受精卵相同的核等价性 (nuclear equivalency) 或基因组连续性，一直是发育生物学要解决的问题。早在30 年代，着名的胚胎学家 Spemann 就已经提出“分化了的细胞核移入卵子中能否指导胚胎发育”这样的设想。用两栖类动物进行的一些克隆实验表明，早期胚胎细胞核经移植可产生成熟的动物个体，而从蝌蚪及成体动物细胞中取出的细胞核经移植生成的克隆动物最晚只能发育至蝌蚪期。胚胎分割及胚胎细胞核移植克隆动物已在许多物种中获得了成功。体细胞克隆绵羊、小鼠、牛 及山羊的成功，证明高度分化的细胞核仍具有全能性。
3. 体细胞克隆羊及小鼠实验成功分析
克隆羊Dolly 是世界上第一只由成体细胞通过无性过程产生的哺乳动物。
1996年7月里的一天，对英国爱丁堡罗斯林（Roslin）研究所由伊恩·维尔穆特（I. Wilmut）领导的科学研究小组全体成员来讲，是一个令人激动的日子。对全世界来说，也是值得庆贺的一天。因为在这一天，一只妊娠了148天，体重为6.6千克, 编号为6LL3的小羊来到了这个世界。这只羊的身世与众不同，它既无父亲，又无母亲，它是科学家们用克隆技术复制出来的一只小绵羊。经过几个月的精心呵护，这只身世不凡的小绵羊茁壮成长，并获得了一个动听的名字——多莉（Dolly）。
1997年2月23日，伊恩. 维尔穆特科学研究小组向全世界宣布了他们的研究结果，英国的“自然”杂志（Nature）于1997年2月27日全文刊登了他们的实验结果。这一消息立刻轰动了全世界。各国的报刊，电台，电视台等媒体对此结果纷纷进行了报道和评述。科学家和大学教授也纷纷被邀请到各种媒体讲解，评论“多莉”的身世和它的出生对科学研究、经济发展和社会进步的影响。许多国家的政府官员也纷纷发表讲话，明令不准将“多莉”克隆技术用于人类。由于各种媒体的大量传播，一个新的名词已为广大民众所逐渐知晓的“克隆”。
早在20世纪50年代，美国的科学家以两栖动物和鱼类作研究对象，首创了细胞核移植技术。1986年，英国科学家魏拉德森用胚胎细胞克隆出一只羊，以后又有人相继克隆出牛、鼠、兔、猴等动物。这些克隆动物的诞生，均是利用胚胎细胞作为供体细胞进行细胞核移植而获得成功的。
而克隆绵羊“多利”是用乳腺上皮细胞（体细胞）作为供体细胞进行细胞核移植的，它翻开了生物克隆史上崭新的一页，突破了利用胚胎细胞进行核移植的传统方式，使克隆技术有了长足的进展。
克隆绵羊“多利”没有父亲，多莉”的产生与三只母羊有关；一只是怀孕三个月的芬兰多塞特母绵羊，两只是苏格兰黑面母绵羊。芬兰多塞特母绵羊提供了全套遗传信息，即提供了细胞核（称之为供体）；一只苏格兰黑面母绵羊提供无细胞核的卵细胞；另一只苏格兰黑面母绵羊提供羊胚胎的发育环境—子宫，是“多莉”羊的“生”母。其整个克隆过程简述如下：
1、从芬兰多塞特母绵羊的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的营养培养液中，细胞逐渐停止了分裂，此细胞称之为供体细胞；
2、从一头苏格兰黑面母绵羊的卵巢中取出未受精的卵细胞，并立即将其细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为受体细胞；
3、利用电脉冲的方法，使供体细胞和受体细胞发生融合，最后形成了融合细胞，由于电脉冲还可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能象受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成胚胎细胞；
4、将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成一只小绵羊。
出生的“多莉”小绵羊与多塞特母绵羊具有完全相同的外貌。“多莉”出生后生长正常，并于1997年底与一头威尔士高山羊自然交配怀孕。在1998年4月13日凌晨4时生下了一只雌性的体重为2.7千克的小羊羔，取名为“邦妮（Bonnie）”。这说明生世不凡的“多莉”具有正常的生育能力。随着“多莉”的诞生，不同的实验室也宣称成功地克隆出了猪、猴和牛等，他们所用的生物材料也都是体细胞。
无性繁殖现象在低等植物中是存在的，而按照哺乳动物界的规律，动物的繁衍要由两性生殖细胞来完成，由于父体和母体的遗传物质在后代体内各占一半，因此后代绝对不是父母的复制品。而克隆绵羊的诞生，意味着人类可以利用哺乳动物的一个细胞大量生产出完全相同的生命体，完全打破了亘古不变的自然规律。这是生物工程技术发展史中的一个里程碑，也是人类历史上的一项重大科学突破。
在Dolly 诞生后的一年多时间里，全世界掀起了一股克隆热，并引起了一些激烈的争论和对Dolly身份的质疑。1998 年7 月出版的《Nature》报道两个独立的研究小组分别对Dolly 的血样、供体母羊冷冻组织及其细胞培养物进行卫星DNA 分析和DNA指纹分析，确认三者的一致性，证明Dolly 确实是体细胞克隆动物。在同期《Nature》上，美国夏威夷大学Wakayama 等人报道，由小鼠卵丘细胞 (cumulus cells) 克隆了27 只存活小鼠，其中7只是由克隆小鼠再次克隆的后代。
两栖类和哺乳类核移植实验发现，经核移植的卵母细胞不能正常发育的一个关键问题是供体核和受体卵母细胞之间的细胞周期不相容性。Wilmut 等的成功之处就在于他们找到了一种使供体核和受体卵母细胞更相容的方法。他们通过血清饥饿法使供体核细胞处于二倍体的G0 期，这样处理的供体核在DNA复制的时间上就与处于中期II的受体卵母细胞同步。从建立正确的染色体倍性 (ploidy) 这个角度来看，供体核处于G1 期也可以获得克隆动物。稳定表达b -半乳糖苷酶-新霉素基因的胎儿成纤维细胞作核供体，获得克隆牛证明了这一点。
人们一般认为，供体核和卵母细胞组成的重组胚胎的发育过程与正常状况受精卵相仿。 羊胚胎基因组的转录一直到8～16个细胞才开始，这种转录时间的差异在理论上将允许胚胎有充裕的时间对植入的成体羊细胞核进行重新编程，使其进入胚胎发育期。由于不同的物种胚胎转录的起始时间各异，所以克隆的难易也不同。以往的研究发现，在小鼠的克隆过程中，基因组很早就被激活，移植的细胞核没有足够的时间进行重新编程。因此，许多研究者认为小鼠是最难克隆的动物之一。
Wakayama 等人的工作改变了这种观点。与Wilmut 等的方法相比，Wakayama 等采用了一种新的、相对简单的克隆技术。Dolly 是采用母羊的乳腺组织细胞经过“饥饿“ 培养，与去核的卵细胞进行电融合，促使融合细胞中遗传物质的重编程 (reprogramming), 然后逐步发育成胚胎。克隆小鼠采用核移植的方法，将自然状态下处于G0 期的卵丘细胞作核供体，直接注入去核的卵细胞。小鼠克隆过程中核移植后的重组胚胎放置0～6 小时后再激活，也有异于Wilmut 等用电刺激法同时融合重组胚胎和激活胚胎。Dolly 的产生过程中遗传物质的重编程和卵细胞的激活是电刺激法，而小鼠的克隆则采用在培养基中添加锶离子 (Sr2+) 和细胞松弛素B 的化学方法激活重组胚胎。
4. 动物克隆技术的应用
动物克隆近几年取得的一些突破性进展，为动物发育过程中基因表达的调控及发育生物学、遗传学等相关学科的发展必将产生深远的影响。虽然目前这种方法尚不成熟，但它已显示出诱人的应用前景。
动物克隆技术将首先应用于医药领域。利用体细胞供体经核移植生产转基因动物，可望降低生产成本。到目前为止，产生转基因动物的方法仍主要是1985 年Hammer 等建立的原核显微注射法。但是，这种方法只能使大约5％的动物携带外源基因。外源基因整合入动物基因组是个随机的过程，这导致外源基因在许多转基因动物系中的表达量不够高，而且因整合进生殖细胞的机率低而难以遗传给下一代。Schnieke 等发现，利用体细胞克隆技术生产含人凝血因子 IX 的转基因羊比原核显微注射法要有效得多[8]。其中，两者最显着的差异是体细胞克隆中的受体母羊全都携带外源基因，而原核显微注射法会产生许多不带外源基因的羊羔。这是由于，原核微注射法中所用胚胎在体外培养的时间较短，在此期间被检测为阳性的转基因可能会在以后的发育过程中丢失。用作核移植供体的细胞在体外培养的时间则较长，有较多的检测机会。另外，显微注射法制备的转基因动物的性别只有等到动物出生后才能得知, 而核移植可以通过鉴别核供体的核型而预先得知转基因动物的性别，可选择性地制备雌性的转基因动物, 有利于在母乳中表达外源基因。
克隆技术除了可以生产各种医用人体蛋白外，对人类的细胞和组织治疗也大有好处。利用克隆技术，可以用患者本人细胞培育出新组织，用来治疗糖尿病、帕金森氏症、神经损伤等多种疾病。用这种方法培育出的组织具有与患者正常组织完全相同的基因构成，因此不会产生免疫排斥反应。但是这些都涉及到克隆人这个敏感话题，目前克隆人在许多国家是法律禁止的。随着人类胚胎干细胞培养技术的完善，目前已有两家美国公司开始研究利用克隆技术培育人胚胎，希望大批量生产治疗疾病的干细胞。事实上，几年前人们就曾把人胎儿神经组织用来治疗帕金森氏症。考虑到伦理上的原因，人们也可以用克隆动物的胚胎干细胞作异源移植，以解决人类移植器官供求矛盾。
动物克隆技术还有助于加速动物育种的进程。利用优良动物品种的体细胞作核供体克隆动物，可以避免自然条件下选种所受到的动物生育周期和生育效率的限制，从而大大缩短育种年限，提高育种效率。动物克隆技术用于拯救濒危动物也受到广泛的关注。中国科学院动物研究所陈大元研究员提出用动物克隆技术拯救大熊猫的计划，在国内外均引起一定的反响。
5. 动物克隆技术的不足及未来发展方向
动物克隆技术虽然取得了一定的进展，在生物医药领域也得到了初步应用。但是，该技术目前还很不完善。存活率低是当今核移植技术的最大缺陷。它突出表现为：孕期流产率高，围产期死亡率高，新生儿体重较重及产生后对环境的适应性较差。以成体细胞核作核供体问题更为严重。最近，Shiels 等报道克隆羊的端粒较同年羊短。
Renard 等报道，体细胞核移植可能影响克隆动物免疫系统的正常发育。他们用胚胎细胞克隆牛的耳细胞通过核移植克隆出一头牛。牛犊看起来很健康，但出生一个半月后，它体内的淋巴细胞和红血球急剧减少，不久就死于贫血。尸体解剖发现，该牛犊脾脏、胸腺和淋巴结等淋巴组织都没有得到正常发育。
导致动物克隆存活率低和异常发育的原因很多，缺乏基础理论支撑是其中之一。动物克隆技术的不断完善，还需要分子遗传学、细胞学、发育生物学等相关基础学科的进一步研究和发展。迄今为止，人们虽然在动物克隆过程中已经积累了不少数据，但一些很基本的问题仍亟需解决。
基因组重新编程的机制尚不清楚。人们虽然观测到核移植后细胞核的激活与早期胚胎原核发育类似，但较详细的信息仍不甚明了。其中，成熟促进因子(maturation promoting factor，MPF)、核膜破裂(nuclear envelope breakdown，NEBD) 和早熟染色体凝集 (premature chromosome condensation, PCC) 在基因组重编过程中的作用还需明确。
基因印记 (imprinting) 对核移植后基因组重新编程的影响。基因印记现象在哺乳动物的发育过程中普遍存在，它是指基因的表达与否取决于它们是在父源染色体上还是母源染色体上。有些印记基因只从母源染色体上表达，而有些则只从父源染色体上表达。基因印记与动物克隆技术的成功及不足有何关系值得深入研究。
动物克隆种属及细胞差异的原因。克隆不同种属的动物难易有别，其中的原因目前人们还不清楚。目前可以用作体细胞核移植核供体的细胞类型还较少。Wakayama 等用处于 G0/G1期的卵丘细胞克隆得到小鼠，而他们采用处于G0 期的足细胞 、神经细胞作核供体进行的克隆实验均未获得成活个体，这显示供体核处于G0 期并非保证胚胎发育的充分条件。Dominko等发现去核的牛卵细胞能使来自羊、猴、鼠、猪等不同种属的细胞核激活，并在体外发育为相应的胚胎，但目前还没有一个可继续发育为完整的动物个体。如果这项工作能成功，将十分有利于濒危动物的保护。
动物克隆技术条件的优化还没有解决。如核供体和卵细胞的选材、核质比的选择、重组胚胎的激活方式、是否需要作连续核移植等。
克隆技术被誉为“一座挖掘不尽的金矿”，它在生产实践上具有重要的意义，潜在的经济价值十分巨大。首先，在动物杂种优势利用方面，较常规方法而言，哺乳动物克隆技术费时少、选育的种畜性状稳定；其次，克隆技术在抢救濒危珍稀物种、保护生物多样性方面可发挥重要作用，即使在自然交配成功率很低的情况下，科研人员也可以从濒危珍稀动物个体身上选择适当的体细胞进行无性繁殖，达到有效保护这些物种的目的。
动物克隆技术的重大突破，也带来了广泛的争议。克隆技术对人类来说，是一把“双刃剑”。一方面，它能给人类带来许多益处――诸如保持优良品种、挽救濒危动物、利用克隆动物相同的基因背景进行生物医学研究等；另一方面，它将对生物多样性提出挑战――生物多样性是自然进化的结果，也是进化的动力，有性繁殖是形成生物多样性的重要基础，而“克隆动物”则会导致生物品系减少，个体生存能力下降。
更让人不寒而栗的是，克隆技术一旦被滥用于克隆人类自身，将不可避免地失去控制，带来空前的生态混乱，并引发一系列严重的伦理道德冲突。世界各国政府和科学界已对此高度关注，采取立法等措施明令禁止用克隆技术制造“克隆人”，以保证克隆只用于造福人类，而绝非复制人类。
综上所述，动物克隆研究已在理论基础、技术优化及实际应用等方面取得很大的进展。但该技术目前还很不完善，相关理论研究还很薄弱，人们要提高动物克隆的成功率还需不懈的努力。另外，克隆动物与正常胚胎的发育有何异同，也值得深入研究。这些问题的解决，将有助于加深人们对动物胚胎发育过程中分子机制的认识。
⑼ 甲基化的甲基化的功能
甲基化是蛋白质和核酸的一种重要的修饰，调节基因的表达和关闭，与癌症、衰老、老年痴呆等许多疾病密切相关，是表观遗传学的重要研究内容之一。 最常见的甲基化修饰有DNA甲基化和组蛋白甲基化。
DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。研究证实，CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化导致了人体1/3以上由于碱基转换而引起的遗传病。DNA甲基化主要形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）和少量的N6-甲基腺嘌呤（N6-mA）及7-甲基鸟嘌呤（7-mG）。在真核生物中，5-甲基胞嘧啶主要出现在CpG序列、CpXpG、CCA/TGG和GATC中。
DNA甲基化是指生物体在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DMT) 的催化下，以s-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程。DNA甲基化可以发生在腺嘌呤的N-6位、鸟嘌呤的N-7位、胞嘧啶的C-5位等。但在哺乳动物中DNA甲基化主要发生在5’-CpG-3’的C上生成5-甲基胞嘧啶(5mC)
在哺乳动物中CpG以两种形式存在：一种是分散于DNA序列中；另一种呈现高度聚集状态，人们称之为CpG岛（CpG island）。在正常组织里，70%～90%散在的CpG是被甲基修饰的，而CpG岛则是非甲基化的。正常情况下，人类基因组“垃圾”序列的CpG二核苷酸相对稀少，并且总是处于甲基化状态，与之相反，人类基因组中大小为100-1000bp左右，富含CpG二核苷酸的CpG岛则总是处于未甲基化状态，并且CpG岛常位于转录调控区附近，与56%的人类基因组编码基因相关，因此基因转录区CpG岛的甲基化状态的研究就显得十分重要。人类基因组序列草图分析结果表明，人类基因组CpG岛约为28890个，大部分染色体每1Mb就有5-15个CpG岛，平均值为每Mb含10.5个CpG岛，CpG岛的数目与基因密度有良好的对应关系。
DNA甲基化主要是通过DNA甲基转移酶家族来催化完成的。研究人员在真核生物中发现了3类DNA甲基转移酶(Dnmt1、Dnmt2、Dnmt3a、Dnmt3b).Dnmt1一种是维持性甲基化酶;Dnmt2可与DNA上特异位点结合，但具体作用尚不清楚;Dnmt3a和Dnmt3b是重新甲基化酶，它们使去甲基化的CpG位点重新甲基化，即参与DNA的从头甲基化。在哺乳动物的生殖细胞发育时期和植入前胚胎期，其基因组范围内的甲基化模式通过大规模的去甲基化和接下来的再甲基化过程发生重编程，从而产生具有发育潜能的细胞；在细胞分化的过程中，基因的甲基化状态将遗传给后代细胞。由于DNA甲基化与人类发育和肿瘤疾病的密切关系，特别是CpG岛甲基化所致抑癌基因转录失活问题，DNA甲基化已经成为表观遗传学和表观基因组学的重要研究内容。
组蛋白甲基化是指发生在H3和H4组蛋白N端Arg或Lys残基上的甲基化，由组蛋白甲基转移酶介导催化。组蛋白甲基化的功能主要体现在异染色质形成、基因印记、X染色体失活和转录调控方面。除了存在组蛋白甲基转移酶以外，还发现了去甲基化酶。先前人们认为组蛋白的甲基化作用是稳定而不可逆的，使这种去甲基化酶的发现使组蛋白甲基化过程更具动态性。
⑽ 谈谈你对转基因动物的看法
胚胎发育过程是核质之间、细胞与细胞及细胞与胞外基质按严格的时空秩序相互作用的结果。从全能或多能胚胎干细胞分化为具有独特功能的体细胞，完全取决于基因在时间与地点上的选择性表达。对细胞分化和发育来说，最重要的不是个别基因的表达，而是整个基因网络在时间和空间上的紧密联系和配合。组成包括人体在内的高等动物机体的亿万个细胞，都是由一个受精卵发育而来的。像胚胎干细胞一样，分化了的体细胞仍然具有一整套完整的遗传信息。过去人们认为，细胞的分化程度越高，它指导早期胚胎发育成新个体的能力就越低，高度分化的体细胞甚至完全不具备这种能力。近几年体细胞动物克隆技术上取得的突破，不仅给人们的观念带来了很大的改变，而且由于它所蕴藏的商业和社会价值，在全世界引起了轰动。
1. 动物克隆的理论基础
在许多人眼里，体细胞克隆羊多莉 (Dolly) 的诞生是克隆技术的开始。其实不然。“克隆 (clone)”一词来源于希腊语，原意是用于扦插的枝条，也就是指无性繁殖。克隆在植物界的应用已有上千年的历史，理论上的突破则是本世纪的事。1902 年德国植物学家 Haberlandt指出，植物的体细胞具有母体全部的遗传信息，并具有发育成为完整个体的潜能，因而每个植物细胞都可像胚胎细胞那样，经离体培养再生成为完整植株。这就是所谓的细胞全能性。许多科学家为证实植物细胞的全能性作出了不懈的努力。1958 年，Steward成功地将一个胡萝卜细胞试管培养，长成了一株具有根、茎、叶等器官的完整植株。1964年Guha 和 Maheshwari利用毛叶曼陀罗的花药培育出单倍体植株。这样，植物细胞全能性获得了充分的论证。建立在此基础上的组织培养技术也得到迅速发展。
与植物细胞不同，在动物发育过程中分化了的细胞不能再产生完整的充分分化的个体。然而，动物胚胎的生长、分化和发育是否造成体细胞基因组的不可逆性修饰，即在发育过程中分化了的细胞是否具有与受精卵相同的核等价性 (nuclear equivalency) 或基因组连续性，一直是发育生物学要解决的问题。早在30 年代，着名的胚胎学家 Spemann 就已经提出“分化了的细胞核移入卵子中能否指导胚胎发育”这样的设想。用两栖类动物进行的一些克隆实验表明，早期胚胎细胞核经移植可产生成熟的动物个体，而从蝌蚪及成体动物细胞中取出的细胞核经移植生成的克隆动物最晚只能发育至蝌蚪期。胚胎分割及胚胎细胞核移植克隆动物已在许多物种中获得了成功。体细胞克隆绵羊[1]、小鼠[2,3]、牛[4,5] 及山羊[6]的成功，证明高度分化的细胞核仍具有全能性。
2. 体细胞克隆羊及小鼠实验成功分析
克隆羊Dolly 是世界上第一只由成体细胞通过无性过程产生的哺乳动物。在Dolly 诞生后的一年多时间里，全世界掀起了一股克隆热，并引起了一些激烈的争论和对Dolly身份的质疑。1998 年7 月出版的《Nature》报道两个独立的研究小组分别对Dolly 的血样、供体母羊冷冻组织及其细胞培养物进行卫星DNA 分析和DNA指纹分析，确认三者的一致性，证明Dolly 确实是体细胞克隆动物。在同期《Nature》上，美国夏威夷大学Wakayama 等人报道，由小鼠卵丘细胞 (cumulus cells) 克隆了27 只存活小鼠，其中7只是由克隆小鼠再次克隆的后代。
两栖类和哺乳类核移植实验发现，经核移植的卵母细胞不能正常发育的一个关键问题是供体核和受体卵母细胞之间的细胞周期不相容性。Wilmut 等的成功之处就在于他们找到了一种使供体核和受体卵母细胞更相容的方法。他们通过血清饥饿法使供体核细胞处于二倍体的G0 期，这样处理的供体核在DNA复制的时间上就与处于中期II的受体卵母细胞同步。从建立正确的染色体倍性 (ploidy) 这个角度来看，供体核处于G1 期也可以获得克隆动物。稳定表达b -半乳糖苷酶-新霉素基因的胎儿成纤维细胞作核供体，获得克隆牛证明了这一点[7]。
人们一般认为，供体核和卵母细胞组成的重组胚胎的发育过程与正常状况受精卵相仿。 羊胚胎基因组的转录一直到8～16个细胞才开始，这种转录时间的差异在理论上将允许胚胎有充裕的时间对植入的成体羊细胞核进行重新编程，使其进入胚胎发育期。由于不同的物种胚胎转录的起始时间各异，所以克隆的难易也不同。以往的研究发现，在小鼠的克隆过程中，基因组很早就被激活，移植的细胞核没有足够的时间进行重新编程。因此，许多研究者认为小鼠是最难克隆的动物之一。
Wakayama 等人的工作改变了这种观点。与Wilmut 等的方法相比，Wakayama 等采用了一种新的、相对简单的克隆技术。Dolly 是采用母羊的乳腺组织细胞经过“饥饿“ 培养，与去核的卵细胞进行电融合，促使融合细胞中遗传物质的重编程 (reprogramming), 然后逐步发育成胚胎。克隆小鼠采用核移植的方法，将自然状态下处于G0 期的卵丘细胞作核供体，直接注入去核的卵细胞。小鼠克隆过程中核移植后的重组胚胎放置0～6 小时后再激活，也有异于Wilmut 等用电刺激法同时融合重组胚胎和激活胚胎。Dolly 的产生过程中遗传物质的重编程和卵细胞的激活是电刺激法，而小鼠的克隆则采用在培养基中添加锶离子 (Sr2+) 和细胞松弛素B 的化学方法激活重组胚胎。
3. 动物克隆技术的应用
动物克隆近几年取得的一些突破性进展，为动物发育过程中基因表达的调控及发育生物学、遗传学等相关学科的发展必将产生深远的影响。虽然目前这种方法尚不成熟，但它已显示出诱人的应用前景。
动物克隆技术将首先应用于医药领域。利用体细胞供体经核移植生产转基因动物，可望降低生产成本。到目前为止，产生转基因动物的方法仍主要是1985 年Hammer 等建立的原核显微注射法。但是，这种方法只能使大约5％的动物携带外源基因。外源基因整合入动物基因组是个随机的过程，这导致外源基因在许多转基因动物系中的表达量不够高，而且因整合进生殖细胞的机率低而难以遗传给下一代。Schnieke 等发现，利用体细胞克隆技术生产含人凝血因子 IX 的转基因羊比原核显微注射法要有效得多[8]。其中，两者最显着的差异是体细胞克隆中的受体母羊全都携带外源基因，而原核显微注射法会产生许多不带外源基因的羊羔。这是由于，原核微注射法中所用胚胎在体外培养的时间较短，在此期间被检测为阳性的转基因可能会在以后的发育过程中丢失。用作核移植供体的细胞在体外培养的时间则较长，有较多的检测机会。另外，显微注射法制备的转基因动物的性别只有等到动物出生后才能得知, 而核移植可以通过鉴别核供体的核型而预先得知转基因动物的性别，可选择性地制备雌性的转基因动物, 有利于在母乳中表达外源基因。
克隆技术除了可以生产各种医用人体蛋白外，对人类的细胞和组织治疗也大有好处。利用克隆技术，可以用患者本人细胞培育出新组织，用来治疗糖尿病、帕金森氏症、神经损伤等多种疾病。用这种方法培育出的组织具有与患者正常组织完全相同的基因构成，因此不会产生免疫排斥反应。但是这些都涉及到克隆人这个敏感话题，目前克隆人在许多国家是法律禁止的。随着人类胚胎干细胞培养技术的完善，目前已有两家美国公司开始研究利用克隆技术培育人胚胎，希望大批量生产治疗疾病的干细胞。事实上，几年前人们就曾把人胎儿神经组织用来治疗帕金森氏症。考虑到伦理上的原因，人们也可以用克隆动物的胚胎干细胞作异源移植，以解决人类移植器官供求矛盾。
动物克隆技术还有助于加速动物育种的进程。利用优良动物品种的体细胞作核供体克隆动物，可以避免自然条件下选种所受到的动物生育周期和生育效率的限制，从而大大缩短育种年限，提高育种效率。动物克隆技术用于拯救濒危动物也受到广泛的关注。中国科学院动物研究所陈大元研究员提出用动物克隆技术拯救大熊猫的计划，在国内外均引起一定的反响。
4. 动物克隆技术的不足及未来发展方向
动物克隆技术虽然取得了一定的进展，在生物医药领域也得到了初步应用。但是，该技术目前还很不完善。存活率低是当今核移植技术的最大缺陷。它突出表现为：孕期流产率高，围产期死亡率高，新生儿体重较重及产生后对环境的适应性较差。以成体细胞核作核供体问题更为严重。最近，Shiels 等报道克隆羊的端粒较同年羊短[9]。Renard 等报道，体细胞核移植可能影响克隆动物免疫系统的正常发育[10]。他们用胚胎细胞克隆牛的耳细胞通过核移植克隆出一头牛。牛犊看起来很健康，但出生一个半月后，它体内的淋巴细胞和红血球急剧减少，不久就死于贫血。尸体解剖发现，该牛犊脾脏、胸腺和淋巴结等淋巴组织都没有得到正常发育。
导致动物克隆存活率低和异常发育的原因很多，缺乏基础理论支撑是其中之一。动物克隆技术的不断完善，还需要分子遗传学、细胞学、发育生物学等相关基础学科的进一步研究和发展。迄今为止，人们虽然在动物克隆过程中已经积累了不少数据，但一些很基本的问题仍亟需解决。
基因组重新编程的机制尚不清楚。人们虽然观测到核移植后细胞核的激活与早期胚胎原核发育类似，但较详细的信息仍不甚明了。其中，成熟促进因子(maturation promoting factor，MPF)、核膜破裂(nuclear envelope breakdown，NEBD) 和早熟染色体凝集 (premature chromosome condensation, PCC) 在基因组重编过程中的作用还需明确。
基因印记 (imprinting) 对核移植后基因组重新编程的影响。基因印记现象在哺乳动物的发育过程中普遍存在，它是指基因的表达与否取决于它们是在父源染色体上还是母源染色体上。有些印记基因只从母源染色体上表达，而有些则只从父源染色体上表达。基因印记与动物克隆技术的成功及不足有何关系值得深入研究。
动物克隆种属及细胞差异的原因。克隆不同种属的动物难易有别，其中的原因目前人们还不清楚。目前可以用作体细胞核移植核供体的细胞类型还较少。Wakayama 等用处于 G0/G1期的卵丘细胞克隆得到小鼠，而他们采用处于G0 期的足细胞 、神经细胞作核供体进行的克隆实验均未获得成活个体，这显示供体核处于G0 期并非保证胚胎发育的充分条件。Dominko等发现去核的牛卵细胞能使来自羊、猴、鼠、猪等不同种属的细胞核激活，并在体外发育为相应的胚胎，但目前还没有一个可继续发育为完整的动物个体。如果这项工作能成功，将十分有利于濒危动物的保护。
动物克隆技术条件的优化还没有解决。如核供体和卵细胞的选材、核质比的选择、重组胚胎的激活方式、是否需要作连续核移植等。
综上所述，动物克隆研究已在理论基础、技术优化及实际应用等方面取得很大的进展。但该技术目前还很不完善，相关理论研究还很薄弱，人们要提高动物克隆的成功率还需不懈的努力。另外，克隆动物与正常胚胎的发育有何异同，也值得深入研究。这些问题的解决，将有助于加深人们对动物胚胎发育过程中分子机制的认识。