基因编程脱靶

1. 基因编辑和基因编程有什么区别

基因编辑，修改基因，改变很小。对特定DNA片段的敲除、加入
基因编程，通过计算机编程的方式对基因片段进行重组和修饰，改变很大

2. 基因编辑技术形式有哪些

基因编辑技术形式有：

1、同源重组

同源重组（Homologous recombination）是最早用来编辑细胞基因组的技术方法。同源重组是在DNA的两条相似（同源）链之间遗传信息的交换（重组）。

2、核酸酶

基因编辑的关键是在基因组内特定位点创建DSB。常用的限制酶在切割DNA方面是有效的，但它们通常在多个位点进行识别和切割，特异性较差。为了克服这一问题并创建特定位点的DSB。

基因编辑技术的应用：

基因编辑和牛体外胚胎培养等繁殖技术结合，允许使用合成的高度特异性的内切核酸酶直接在受精卵母细胞中进行基因组编辑。
CRISPR
-Cas9进一步增加了基因编辑在动物基因靶向修饰的应用范围。CRISPR-Cas9允许通过细胞质直接注射从而实现对哺乳动物受精卵多个靶标的一次性同时敲除（KO）。

单细胞基因表达分析已经解决了人类发育的转录路线图，从中发现了关键候选基因用于功能研究。使用全基因组转录组学数据指导实验，基于CRISPR的基因组编辑工具使得干扰或删除关键基因以阐明其功能成为可能。

以上内容参考：网络—基因编辑技术

3. 你如何看待基因编辑技术呢

什么是基因编辑

顾名思义，“基因编辑”就是指对基因进行修改，实现对特定DNA片段的敲除、插入的基因重组技术。

基因编辑可以追溯到上世纪70年代，CRISPR/Cas9是继“锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。

与前两代技术相比，其成本低、制作简便、快捷高效的优点，让它迅速风靡于世界各地的实验室，成为科研、医疗等领域的有效工具。

2在农业上培育出品质优良的动物植物品种 美国和日本相关机构目前的倾向是CRISPR改造的特定农产品不作为转基因食品进行监管。

3建立不同基因型的动物模型这从第一代基因编辑技术就开始做了。建立不同基因型的动物模型的意义在于，对遗传性疾病，这些基因和疾病之间的关系，这些模型可以给出一个比较确切的答案。

现在基因编辑距离应用于临床还有很长一段距离，比如基因编辑的准确定位，如何避免脱靶；会不会有免疫反应；系统毒性等多方面的问题。

4. 韩春雨基因编辑技术真的厉害吗

一项DNA编辑技术是否有优势涉及到方方面面。从目前的情况来看，NgAgo的优势很明显，主要体现在
1）反应效率不低（不说高，但不低）
2）特异性较好（但有人引用说因为gDNA比Cas9的gRNA 长5nt，所以精确度提高1024倍，这个“理论上”的4^5不得不说是噱头，因为脱靶率（精度）不是这个意思，这样外行的计算是不该的）
3）不依赖PAM
4）NgAgo本身分子量不大

另外还有一些文章中作为优势，但也可能是劣势的性质（比如使用ssDNA介导，提高特异性同时会带来很多问题）不论如何优势是明显的，但是仅仅这些方面并不够，还需要研究更多问题，比如特异性好是有限实验基础上的理论结论，实际应用脱靶率如何要看具体情况。

目前来看有几项事关这项技术未来的、优先待验证的问题是：
1）系统正交性
2）多位点编辑能力
3）NgAgo蛋白的模块化程度（工程化改造的潜力）
4）ssDNA的通用性和缺点

不要小看上述问题，条条都是卡脖子的，一条不给力就会被CRISPR比下去。很多人知道CRISPR很火，也知道CRISPR是很好的基因组编辑工具，容易以为基因编辑工具本身是很牛的，实际上CRISPR之所以火，还有很大一部分原因在于高正交性、高通用性、高工程化潜力带来的广泛应用，诸如转录后调控、人工TF等等。核酸定点内切是一个基础性质，带来了上述性质的可能性，需要经过验证才能就是否可以作为CRISPR的替代技术有一个结论。

比如在不同物种细胞系统中的正交性如何？目前知道Ago在真核到原核细胞中广泛存在同源基因，这个在文章中是作为某种优势来讲的，但实际上可能是一个劣势。因为正交性问题，在人类细胞中好用未必在其它物种平台中好用。大家可能注意到了，文章开篇第二个实验就是做了一个简单的正交性测试，测试结果还不错，文中提到
which implies that there is very limited 5 ′ phosphorylated ssDNA present in human cells, suggesting that endogenous ssDNAs will not mislead NgAgo to off-target sites
这当然不足以说明NgAgo具有高正交性，作者也用了implies的措辞，还有待进一步证实。可以从文中看出，作者最担心的问题其实也是系统正交性，在文章最后，作者特意强调需要进一步的高通量实验来研究这个问题，可见作者并非没有意识到，而是受限于时间或其它科研条件。

除此之外，多位点编辑能力是CRISPR的一项重大优势。我们现在知道NgAgo和ssDNA的结合是非常稳定的（在37℃条件下不可逆），这当然是某种提高特异性的优势，但稳定也是双刃剑，有可能成为劣势。文中提到：
similar to mammalian Ago2, which cannot exchange its bound oligos with free oligos at 37 °C
这样的性质是否会影响到NgAgo在多位点编辑中的反应效率不得而知。我看到大部分评论都没有提到这个问题。

CRISPR还有一个亮点是Cas9的模块化性质。可以容许进行较多的蛋白工程改造，NgAgo是否有这样的高度模块化的性质也将直接决定这项技术能否问鼎优秀DNA编辑技术的地位。如果对蛋白质工程设计的可扩展性不好，那么其应用很有可能受限。

最后还有ssDNA在各种细胞平台中如何使用等问题，我们现在知道CRISPR系统常导入gRNA或通过sgRNA transcription vector来制造介导核酸，DNA显然不能用这招，直接导入DNA本身就限制了NgAgo在一大类物种当中的应用潜力。有同学展望天然的5'p-ssDNA的加工机制未来可以利用，然而文章中提到人类细胞中5'p-ssDNA并不丰富。这有利于系统正交性，却也暗示ssDNA的使用有可能成为这项技术的一个瓶颈。有一位答主说ssDNA的用量只要CRISPR技术中RNA用量的1/10，这显然是英文不好造成了误读，文章中原文是：
if the sgRNA is expressed from a plasmid and the normal dosage of an ssDNA guide is only ~1/10 of that of a sgRNA expression plasmid
可见，特异性ssDNA在这项实验中是可以通过使用浓度饱和来增强NgAgo的特异性的（与破坏正交性的ssDNA竞争性结合NgAgo），但是这个robustness是一柄双刃剑。DNA分子本身的稳定性、系统的鲁棒性和使用方式会影响这个系统的可控性。一旦系统可控性不好，基本上会被最重要的生物医疗领域排除在外。

5. 扒一扒基因编辑技术的“真面目”

自2016年5月2日韩春雨作为通讯作者的“基因编辑技术NgAgo”论文发表引起关注、5月底质疑的声音开始出现，韩春雨实验的可重复争议，不仅科学界议论纷纷，在社会层面也引发了相关讨论。那么，基因编辑技术到底是一项怎么样的技术呢？为什么它这样备受瞩目？今天我们就一起去扒一扒基因编辑技术的“真面目”！

基因编辑技术有什么用?

我们研究基因编辑技术，那基因编辑技术到底可以应用在哪些方面呢？主要有以下这几个方面：第一个就是可以形成不同基因型的动物模型，这从第一代基因编辑技术就开始做了。建立不同基因型的动物模型的意义在于，对遗传性疾病，这些基因和疾病之间的关系，这些模型可以给出一个比较确切的答案。这对研究遗传性疾病具有重大意义，这也是为什么大家从第一代开始就密切关注基因编辑技术的发展了。

第二个主要是应用在动植物育种。不同的物种的同一个基因上，可能会存在不同的SNP。不同的SNP对正常的生理功能影响是不大的，但是却会影响一定的表型。比如水稻是不是就会更高产一些，动物的瘦肉是不是更多一些等等表型。有了基因编辑技术，在育种的过程中，我们就可以对我们最想要的某一个基因进行单点突出，以实现效益的最大化。目前为止，第三代基因编辑技术效率相比于前两代技术来说是最高的。

还有一个就是对遗传疾病的治疗比较有用。目前来说，基因编辑技术主要是用在人源性的细胞上面，临床还没有用到。我们知道，很多遗传疾病都和细胞的突变有关。如果说利用基因编辑技术，我们能够把致病的基因转换成正常的基因的话，那么对家族有遗传病史的人来说，这将是一个福音。

但是现在的基因编辑技术离临床治疗还远。要应用到临床上需要考虑很多问题，比如这个系统的毒性怎么样？它进去以后会不会引起什么免疫反应？因为现在基因编辑技术还存在脱靶效应，如何对我们要编辑的基因进行准确地定位是个大问题。这些都是需要研究清楚才能上临床的。

（作者：胡昕华，中国科学院神经科学研究所博士。感谢中国科学技术大学化学博士，中国科学技术大学合肥微尺度物质科学国家实验室副研究员，科技与战略风云学会会长袁岚峰的推荐，原创作品，转载请注明出自知识就是力量微信公众号）

（图片来自网络）

编辑：刘伟琼

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6. 第三代基因编辑技术指的是

自2016年5月2日韩春雨作为通讯作者的“基因编辑技术NgAgo”论文发表引起关注、5月底质疑的声音开始出现，韩春雨实验的可重复争议，不仅科学界议论纷纷，在社会层面也引发了相关讨论。那么，基因编辑技术到底是一项怎么样的技术呢？为什么它这样备受瞩目？今天我们就一起去扒一扒基因编辑技术的“真面目”！

（图片来自网络）

基因编辑技术到底是个什么鬼？

首先我们先介绍一下基因编辑的概念。实际上，“基因编辑”这四个字是比较简化的，严格来说我们应该称它为“基因组定点编辑技术”。这里我们要注意两个关键词，一个是“基因组”，它要在细胞核的基因组里面。

另一个是“定点编辑”，因为在细胞核的基因组里面，不同的基因都有不同的位点。如果我们不是说在特定的基因组位点进行编辑的话，实际上和我们现在讨论的这个技术就大相径庭了。因为有很多其他技术可以改变细胞内的DNA组成。比如线粒体基因替代技术。还有一个就是用重组过的特异性病毒引入外源基因，但是它不能够定点，它是随机放到基因组里面的，这和我们今天要讨论的基因编辑技术都是不一样的。基因编辑技术，也就是“基因组定点编辑技术”，这个技术指的是对特定DNA片段的敲除、加入以及定点突变。

（图片来自网络）

基因编辑技术的历史

实际上，基因编辑技术不是一个新的概念，早在90年代就开始有了。到目前为止，已经经历了三代。

第一代基因编辑技术就是同源重组建立动物基因敲除（knock-out），基因敲入（knock-in）的基因突变模型。顾名思义，基因敲除（knock-out）指的是把原有的动物基因组的某些基因通过一定的技术把它从动物基因组里敲除出去；基因敲入（knock-in）则是在动物基因组某个位点上把原本不存在的基因通过一定的技术把它整合进去。基因敲除（knock-out）和基因敲入（knock-in）是通过DNA同源重组技术来完成的。这是一个非常复杂的技术。如果要做成一个成功的动物基因敲除（knock-out），基因敲入（knock-in）的基因突变模型，大概需要花费2到3年的时间，投入的资金也比较多。另外，这个技术一般来说是用于建立遗传疾病研究的动物模型，很难用于临床或者说大面积应用在农业畜牧业方面。

第二代基因编辑技术是ZFN,TALEN技术。这两个技术的原理都是通过DNA核酸结合蛋白和核酸内切酶结合在一起建立一个系统。因为这些蛋白可以识别一定的核苷酸序列，通过一定设计形成的系统可以对特定的基因进行基因敲除和基因突变。

第三代基因编辑技术就是最近非常火的CRISPR/Cas9 系统。它的原理就是利用核糖体结构来进行基因编辑。CRISPR/Cas9 系统经过一定的设计可以结合到靶基因上，然后对这个靶基因进行敲除、定点突变或者引入新的外源基因，来进行基因编辑。

（图片来自网络）

为什么第三代基因编辑技术备受瞩目？

确切地说，这三代基因编辑技术到目前为止都存在一定的技术局限性。第一个比较明显的局限性就是脱靶效应。那什么是脱靶效应呢？比如原本设计是对某一个DNA靶点进行基因编辑，但是一直找一直找，却没有找到正确的靶点，实际上却跑到这个点组成相似的位点去了，这就出现了脱靶。

7. 基因编辑婴儿技术的坏处，辩论赛

在目前的基因技术下，基因编辑脱靶的可能性极大，造成相邻基因的变异，带来不可预估的风险，等婴儿长大结婚生子又会把基因变异的风险传播开来，潘多拉魔盒被打开，人类是否能做好应对的措施还未可知。因为现实并不像《神盾局特工》等美剧演绎的那样精彩。变异带来的是排斥与恐慌。

8. 基因编辑技术是什么它是如何在医学领域应用的

基因编辑技术可以准确地改造人类基因，达到基因治疗效果。中国科学院生物化学与细胞生物学研究所李劲松研究组通过在小鼠胚胎中注射CRISPR/Cas9纠正白内障小鼠模型中的遗传缺陷，所产生的后代是可育的并能将修正后的等位基因传递给它们的后代。杜氏肌营养不良（DMD）是一种罕见的肌肉萎缩症，也是最常见的致命性遗传病之一，是由肌营养不良蛋白dystrophin基因突变引起。杜克大学Charles Gersbach研究组应用CRISPR/Cas9在DMD小鼠中将dystrophin基因突变的23外显子剪切，而合成了一个截短的但功能很强的抗肌萎缩蛋白，这是生物学家“首次成功地利用CRISPR基因编辑技术治愈了一只成年活体哺乳动物的遗传疾病”。

►CAR-T治疗简图，图片来自onclive.com

基因编辑技术联合免疫疗法在肿瘤及HIV/AIDS治疗具有广泛的应用前景。嵌合抗原受体T细胞（Chimeric Antigen Receptor T cell，CAR-T）细胞治疗是非常有前景的肿瘤治疗方法。CAR-T细胞疗法在B细胞恶性血液肿瘤治疗中已经取得硕果。中科院动物研究所王皓毅研究组利用CRISPR/Cas9技术在CAR-T细胞中进行双基因（TCRα subunit constant 和beta-2 microglobulin）或三基因（TRAC，B2M及programmed death-1）敲除。美国斯隆凯特林癌症纪念中心Michel Sadelain研究组发现CRISPR/Cas9技术将CAR基因特异性靶向插入到细胞的TRAC基因座位点，极大增强了T细胞效力，编辑的细胞大大优于传统在急性淋巴细胞白血病小鼠模型中产生CAR-T细胞。

继诺华的Kymriah以及Gilead （kite Pharma）的Yescarta接连上市，CRISPR Therapeutics公司也在应用CRISPR/Cas9基因编辑技术开发同种异体CAR-T候选产品。2016年10月，四川大学华西医院的肿瘤医生卢铀领导的一个团队首次在人体中开展CRISPR试验，从晚期非小细胞肺癌患者体内提取出免疫细胞，再利用CRISPR/Cas9技术剔除细胞中的PD-1基因更有助于激活T细胞去攻击肿瘤细胞，最后将基因编辑过的细胞重新注入患者体内。

微生物种群与人体医学，自然环境息息相关。北卡罗来纳大学Rodolphe Barrangou与Chase L. Beisel合作通过使用基因组靶向CRISPR/Cas9系统可靶向并区分高度密切相关的微生物，并程序性去除细菌菌株，意味着CRISPR/Cas9系统可开发成精细微生物治疗体系来剔除有害致病菌，人类将有可能精确控制微生物群体的组成。以色列特拉维夫大学Udi Qimron将CRISPR系统导入温和噬菌体中在侵染具有抗生素抗性的细菌以消灭此类细菌，CRISPR系统已具有成为新一类抗生素的潜力。Locus BioSciences公司也在开发在噬菌体中开发CRISPR系统以达消灭难辨梭菌的目的。

弗吉尼亚理工大学Zhijian Tu研究组在雄蚊子中进行M因子基因编辑，可以导致雌雄蚊之间的转化或雌蚊的杀戮，从而实现有效的性别分离和有效减少蚊子的数量，也将减少寨卡病毒及疟疾等传播。

基于CRISPR治疗不仅可以应用于根除共生菌或有益菌群的病原体，也可应用于靶向人类病毒，包括HIV-1，疱疹病毒，乳头瘤病毒及乙型肝炎病毒等。具有纯合的32-bp缺失（Δ32）的CC趋化因子受体5型（CCR5）基因的患者对HIV感染具有抗性。因此加利福尼亚大学Yuet Wai Kan在诱导多能干细胞iPSC中利用CRISPR系统引入纯合CCR5Δ32突变后，诱导分化后的单核细胞和巨噬细胞对HIV感染具有抗性。天普大学Kamel Khalili 课题组应用CRISPR/Cas9系统在宿主细胞基因组中精确编辑HIV-1 LTR U3区，从而在将艾滋病病毒从基因组中剔除。

Cas12a （Cpf1）属于CRISPR家族另一核酸内切酶，它也可被gRNA引导并剪切DNA。但是，它不仅可以切割相结合的单链或双链DNA，也剪切其他的DNA。近日，加州大学伯克利分校Jennifer Doudna研究组开发了基于CRISPR的一项新技能——基因侦探（DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter (DETECTR)）。利用单链DNA将荧光分子和淬灭分子连接构建成一个报告系统，当CRISPR-Cas12a在gRNA引导下结合到目标DNA并发挥剪切作用时，报告系统中的DNA也被剪切，荧光分子将被解除抑制。此系统在致癌性HPV的人的DNA样品检测HPV16和HPV18变现极佳。

布罗德研究所Feng Zhang研究组开发的基于CRISPR的2代SHERLOCK （Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing），原理是利用Cas13a被激活后，可以切割除靶序列外其他的RNA的特征，引入了解除荧光分子的抑制。此工具可实现一次性多重核酸检测，可同时检测4种靶标分子，额外添加的Csm6使得这种工具比它的前身具有更高的灵敏度，并将它开发成微型试纸条检测方法，简单明了易操作，已被研究人员成功应用于RNA病毒，如登革热病毒和寨卡病毒，及人体液样本检测。

Broad研究所David R. Liu研究组利用CRISPR/Cas9开发了一种被称为CAMERA（CRISPR-mediated analog multi-event recording apparatus）的记录细胞事件的“黑匣子”他们利用这个系统开发出两种细胞记录系统，在第一种被称为“CAMERA 1”的细胞记录系统中，研究人员利用细菌中质粒的自我复制但又严格控制其自身数量的特征，

将两种彼此之间略有不同的质粒以稳定的比例转化到细菌中，随后在接触到外来药物刺激时，利用CRISPR/Cas9对这两种质粒中的一种进行切割，通过对质粒进行测序并记录两种质粒比例的变化来记录细菌接触外来刺激的时间。另一种细胞记录系统被称为“CAMERA 2”，它利用基于CRISPR/Cas9的碱基编辑系统实现在细胞内特定信号发生时改变遗传序列中的单个碱基，以此实现对诸如感染病毒、接触营养物等刺激的记录。这套技术的出现将很大程度的帮助人们进一步了解细胞的各类生命活动的发生发展规律。

2015 年 4 月，中山大学的黄军利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术，同源重组修复了胚胎中一个引发地中海贫血β-globin gene （HBB）的突变。

►图片来自kurzgesagt.org

2016年，广州医科大学的范勇团队在三原核受精卵中，应用基因编辑技术CRISPR受精卵中的基因CCR5进行编辑引入CCR5Δ32纯合突变由于当时脱靶效率问题突出，产生了镶嵌式的受精卵。

2017年8月2日，俄勒冈健康与科学大学胚胎细胞和基因治疗中心Shoukhrat Mitalipov研究组公布了其应用CRISPR在人类胚胎中进行DNA编辑的结果，纠正了突变的MYBPC3基因，其突变会引起心肌肥厚并将年轻运动员猝死。

9. 请问什么是基因编辑，如何编辑

"公众对转基因担心的并不是基因技术，关键是转基因的“转”，现在通过基因测序研究已发展出基因编辑技术，可根据需要对原来的基因进行重新编辑，它可以不转任何新的基因，也能产生很好效果。中国今后将在进一步开展转基因研究的同时，积极推动基因编辑技术研究"。大妈连基因编辑都知道，真是厉害啊。既然提到这个，我就来科普一下啦。这个技术被Science期刊列为2013年十大突破中的第二位。导引RNA-Cas9系统是目前最简单有效的基因编辑方法。这个系统本身最初是受细菌抵抗噬菌体的启发。理论上你可以合成跟任何基因的DNA互补的导引RNA，这个RNA通过DNA-RNA序列互补（碱基配对），把核酸酶Cas9定位到目标基因，然后Cas9利用它的核酸酶活性把目标基因在特定的部位切断。之后，细胞自身的DNA损伤修复机制可以被用来改变目标基因Cas9切割点附近的DNA序列。这个系统可以用来选择性剔除某个基因，控制目标基因的转录活性，甚至有可能用来纠正导致遗传性疾病的突变基因。可是说到底，这个系统还是需要导入外源蛋白Cas9（最常用的是来自链球菌的Cas9)。另外，基因编辑只是对内源（原有）基因的修饰，而作物之所以需要转基因，常常是因为它们的内源基因里面没有包括编码某些有益性状的基因。如果要把内源的某个基因就地变成一个新的基因，即使技术上可以做到，带来的坏处也很可能超过好处（当然在特定条件下可能有例外），因为这个基因就会失去了原来该有的功能。当然，在有的情况下，可以利用基因编辑技术改变基因组里面某些基因的表达水平，就可以加强某些有益的性状和减弱某些有害性状。总之反转跟信教一样，是一种思维定式，基本上无解，不是技术手段可以解决的问题。