基因編程脫靶

1. 基因編輯和基因編程有什麼區別

基因編輯，修改基因，改變很小。對特定DNA片段的敲除、加入
基因編程，通過計算機編程的方式對基因片段進行重組和修飾，改變很大

2. 基因編輯技術形式有哪些

基因編輯技術形式有：

1、同源重組

同源重組（Homologous recombination）是最早用來編輯細胞基因組的技術方法。同源重組是在DNA的兩條相似（同源）鏈之間遺傳信息的交換（重組）。

2、核酸酶

基因編輯的關鍵是在基因組內特定位點創建DSB。常用的限制酶在切割DNA方面是有效的，但它們通常在多個位點進行識別和切割，特異性較差。為了克服這一問題並創建特定位點的DSB。

基因編輯技術的應用：

基因編輯和牛體外胚胎培養等繁殖技術結合，允許使用合成的高度特異性的內切核酸酶直接在受精卵母細胞中進行基因組編輯。
CRISPR
-Cas9進一步增加了基因編輯在動物基因靶向修飾的應用范圍。CRISPR-Cas9允許通過細胞質直接注射從而實現對哺乳動物受精卵多個靶標的一次性同時敲除（KO）。

單細胞基因表達分析已經解決了人類發育的轉錄路線圖，從中發現了關鍵候選基因用於功能研究。使用全基因組轉錄組學數據指導實驗，基於CRISPR的基因組編輯工具使得干擾或刪除關鍵基因以闡明其功能成為可能。

以上內容參考：網路—基因編輯技術

3. 你如何看待基因編輯技術呢

什麼是基因編輯

顧名思義，「基因編輯」就是指對基因進行修改，實現對特定DNA片段的敲除、插入的基因重組技術。

基因編輯可以追溯到上世紀70年代，CRISPR/Cas9是繼「鋅指核酸內切酶（ZFN）」、「類轉錄激活因子效應物核酸酶（TALEN）」之後出現的第三代「基因組定點編輯技術」。

與前兩代技術相比，其成本低、製作簡便、快捷高效的優點，讓它迅速風靡於世界各地的實驗室，成為科研、醫療等領域的有效工具。

2在農業上培育出品質優良的動物植物品種 美國和日本相關機構目前的傾向是CRISPR改造的特定農產品不作為轉基因食品進行監管。

3建立不同基因型的動物模型這從第一代基因編輯技術就開始做了。建立不同基因型的動物模型的意義在於，對遺傳性疾病，這些基因和疾病之間的關系，這些模型可以給出一個比較確切的答案。

現在基因編輯距離應用於臨床還有很長一段距離，比如基因編輯的准確定位，如何避免脫靶；會不會有免疫反應；系統毒性等多方面的問題。

4. 韓春雨基因編輯技術真的厲害嗎

一項DNA編輯技術是否有優勢涉及到方方面面。從目前的情況來看，NgAgo的優勢很明顯，主要體現在
1）反應效率不低（不說高，但不低）
2）特異性較好（但有人引用說因為gDNA比Cas9的gRNA 長5nt，所以精確度提高1024倍，這個「理論上」的4^5不得不說是噱頭，因為脫靶率（精度）不是這個意思，這樣外行的計算是不該的）
3）不依賴PAM
4）NgAgo本身分子量不大

另外還有一些文章中作為優勢，但也可能是劣勢的性質（比如使用ssDNA介導，提高特異性同時會帶來很多問題）不論如何優勢是明顯的，但是僅僅這些方面並不夠，還需要研究更多問題，比如特異性好是有限實驗基礎上的理論結論，實際應用脫靶率如何要看具體情況。

目前來看有幾項事關這項技術未來的、優先待驗證的問題是：
1）系統正交性
2）多位點編輯能力
3）NgAgo蛋白的模塊化程度（工程化改造的潛力）
4）ssDNA的通用性和缺點

不要小看上述問題，條條都是卡脖子的，一條不給力就會被CRISPR比下去。很多人知道CRISPR很火，也知道CRISPR是很好的基因組編輯工具，容易以為基因編輯工具本身是很牛的，實際上CRISPR之所以火，還有很大一部分原因在於高正交性、高通用性、高工程化潛力帶來的廣泛應用，諸如轉錄後調控、人工TF等等。核酸定點內切是一個基礎性質，帶來了上述性質的可能性，需要經過驗證才能就是否可以作為CRISPR的替代技術有一個結論。

比如在不同物種細胞系統中的正交性如何？目前知道Ago在真核到原核細胞中廣泛存在同源基因，這個在文章中是作為某種優勢來講的，但實際上可能是一個劣勢。因為正交性問題，在人類細胞中好用未必在其它物種平台中好用。大家可能注意到了，文章開篇第二個實驗就是做了一個簡單的正交性測試，測試結果還不錯，文中提到
which implies that there is very limited 5 ′ phosphorylated ssDNA present in human cells, suggesting that endogenous ssDNAs will not mislead NgAgo to off-target sites
這當然不足以說明NgAgo具有高正交性，作者也用了implies的措辭，還有待進一步證實。可以從文中看出，作者最擔心的問題其實也是系統正交性，在文章最後，作者特意強調需要進一步的高通量實驗來研究這個問題，可見作者並非沒有意識到，而是受限於時間或其它科研條件。

除此之外，多位點編輯能力是CRISPR的一項重大優勢。我們現在知道NgAgo和ssDNA的結合是非常穩定的（在37℃條件下不可逆），這當然是某種提高特異性的優勢，但穩定也是雙刃劍，有可能成為劣勢。文中提到：
similar to mammalian Ago2, which cannot exchange its bound oligos with free oligos at 37 °C
這樣的性質是否會影響到NgAgo在多位點編輯中的反應效率不得而知。我看到大部分評論都沒有提到這個問題。

CRISPR還有一個亮點是Cas9的模塊化性質。可以容許進行較多的蛋白工程改造，NgAgo是否有這樣的高度模塊化的性質也將直接決定這項技術能否問鼎優秀DNA編輯技術的地位。如果對蛋白質工程設計的可擴展性不好，那麼其應用很有可能受限。

最後還有ssDNA在各種細胞平台中如何使用等問題，我們現在知道CRISPR系統常導入gRNA或通過sgRNA transcription vector來製造介導核酸，DNA顯然不能用這招，直接導入DNA本身就限制了NgAgo在一大類物種當中的應用潛力。有同學展望天然的5'p-ssDNA的加工機制未來可以利用，然而文章中提到人類細胞中5'p-ssDNA並不豐富。這有利於系統正交性，卻也暗示ssDNA的使用有可能成為這項技術的一個瓶頸。有一位答主說ssDNA的用量只要CRISPR技術中RNA用量的1/10，這顯然是英文不好造成了誤讀，文章中原文是：
if the sgRNA is expressed from a plasmid and the normal dosage of an ssDNA guide is only ~1/10 of that of a sgRNA expression plasmid
可見，特異性ssDNA在這項實驗中是可以通過使用濃度飽和來增強NgAgo的特異性的（與破壞正交性的ssDNA競爭性結合NgAgo），但是這個robustness是一柄雙刃劍。DNA分子本身的穩定性、系統的魯棒性和使用方式會影響這個系統的可控性。一旦系統可控性不好，基本上會被最重要的生物醫療領域排除在外。

5. 扒一扒基因編輯技術的「真面目」

自2016年5月2日韓春雨作為通訊作者的「基因編輯技術NgAgo」論文發表引起關注、5月底質疑的聲音開始出現，韓春雨實驗的可重復爭議，不僅科學界議論紛紛，在社會層面也引發了相關討論。那麼，基因編輯技術到底是一項怎麼樣的技術呢？為什麼它這樣備受矚目？今天我們就一起去扒一扒基因編輯技術的「真面目」！

基因編輯技術有什麼用?

我們研究基因編輯技術，那基因編輯技術到底可以應用在哪些方面呢？主要有以下這幾個方面：第一個就是可以形成不同基因型的動物模型，這從第一代基因編輯技術就開始做了。建立不同基因型的動物模型的意義在於，對遺傳性疾病，這些基因和疾病之間的關系，這些模型可以給出一個比較確切的答案。這對研究遺傳性疾病具有重大意義，這也是為什麼大家從第一代開始就密切關注基因編輯技術的發展了。

第二個主要是應用在動植物育種。不同的物種的同一個基因上，可能會存在不同的SNP。不同的SNP對正常的生理功能影響是不大的，但是卻會影響一定的表型。比如水稻是不是就會更高產一些，動物的瘦肉是不是更多一些等等表型。有了基因編輯技術，在育種的過程中，我們就可以對我們最想要的某一個基因進行單點突出，以實現效益的最大化。目前為止，第三代基因編輯技術效率相比於前兩代技術來說是最高的。

還有一個就是對遺傳疾病的治療比較有用。目前來說，基因編輯技術主要是用在人源性的細胞上面，臨床還沒有用到。我們知道，很多遺傳疾病都和細胞的突變有關。如果說利用基因編輯技術，我們能夠把致病的基因轉換成正常的基因的話，那麼對家族有遺傳病史的人來說，這將是一個福音。

但是現在的基因編輯技術離臨床治療還遠。要應用到臨床上需要考慮很多問題，比如這個系統的毒性怎麼樣？它進去以後會不會引起什麼免疫反應？因為現在基因編輯技術還存在脫靶效應，如何對我們要編輯的基因進行准確地定位是個大問題。這些都是需要研究清楚才能上臨床的。

（作者：胡昕華，中國科學院神經科學研究所博士。感謝中國科學技術大學化學博士，中國科學技術大學合肥微尺度物質科學國家實驗室副研究員，科技與戰略風雲學會會長袁嵐峰的推薦，原創作品，轉載請註明出自知識就是力量微信公眾號）

（圖片來自網路）

編輯：劉偉瓊

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6. 第三代基因編輯技術指的是

自2016年5月2日韓春雨作為通訊作者的「基因編輯技術NgAgo」論文發表引起關注、5月底質疑的聲音開始出現，韓春雨實驗的可重復爭議，不僅科學界議論紛紛，在社會層面也引發了相關討論。那麼，基因編輯技術到底是一項怎麼樣的技術呢？為什麼它這樣備受矚目？今天我們就一起去扒一扒基因編輯技術的「真面目」！

（圖片來自網路）

基因編輯技術到底是個什麼鬼？

首先我們先介紹一下基因編輯的概念。實際上，「基因編輯」這四個字是比較簡化的，嚴格來說我們應該稱它為「基因組定點編輯技術」。這里我們要注意兩個關鍵詞，一個是「基因組」，它要在細胞核的基因組裡面。

另一個是「定點編輯」，因為在細胞核的基因組裡面，不同的基因都有不同的位點。如果我們不是說在特定的基因組位點進行編輯的話，實際上和我們現在討論的這個技術就大相徑庭了。因為有很多其他技術可以改變細胞內的DNA組成。比如線粒體基因替代技術。還有一個就是用重組過的特異性病毒引入外源基因，但是它不能夠定點，它是隨機放到基因組裡面的，這和我們今天要討論的基因編輯技術都是不一樣的。基因編輯技術，也就是「基因組定點編輯技術」，這個技術指的是對特定DNA片段的敲除、加入以及定點突變。

（圖片來自網路）

基因編輯技術的歷史

實際上，基因編輯技術不是一個新的概念，早在90年代就開始有了。到目前為止，已經經歷了三代。

第一代基因編輯技術就是同源重組建立動物基因敲除（knock-out），基因敲入（knock-in）的基因突變模型。顧名思義，基因敲除（knock-out）指的是把原有的動物基因組的某些基因通過一定的技術把它從動物基因組里敲除出去；基因敲入（knock-in）則是在動物基因組某個位點上把原本不存在的基因通過一定的技術把它整合進去。基因敲除（knock-out）和基因敲入（knock-in）是通過DNA同源重組技術來完成的。這是一個非常復雜的技術。如果要做成一個成功的動物基因敲除（knock-out），基因敲入（knock-in）的基因突變模型，大概需要花費2到3年的時間，投入的資金也比較多。另外，這個技術一般來說是用於建立遺傳疾病研究的動物模型，很難用於臨床或者說大面積應用在農業畜牧業方面。

第二代基因編輯技術是ZFN,TALEN技術。這兩個技術的原理都是通過DNA核酸結合蛋白和核酸內切酶結合在一起建立一個系統。因為這些蛋白可以識別一定的核苷酸序列，通過一定設計形成的系統可以對特定的基因進行基因敲除和基因突變。

第三代基因編輯技術就是最近非常火的CRISPR/Cas9 系統。它的原理就是利用核糖體結構來進行基因編輯。CRISPR/Cas9 系統經過一定的設計可以結合到靶基因上，然後對這個靶基因進行敲除、定點突變或者引入新的外源基因，來進行基因編輯。

（圖片來自網路）

為什麼第三代基因編輯技術備受矚目？

確切地說，這三代基因編輯技術到目前為止都存在一定的技術局限性。第一個比較明顯的局限性就是脫靶效應。那什麼是脫靶效應呢？比如原本設計是對某一個DNA靶點進行基因編輯，但是一直找一直找，卻沒有找到正確的靶點，實際上卻跑到這個點組成相似的位點去了，這就出現了脫靶。

7. 基因編輯嬰兒技術的壞處，辯論賽

在目前的基因技術下，基因編輯脫靶的可能性極大，造成相鄰基因的變異，帶來不可預估的風險，等嬰兒長大結婚生子又會把基因變異的風險傳播開來，潘多拉魔盒被打開，人類是否能做好應對的措施還未可知。因為現實並不像《神盾局特工》等美劇演繹的那樣精彩。變異帶來的是排斥與恐慌。

8. 基因編輯技術是什麼它是如何在醫學領域應用的

基因編輯技術可以准確地改造人類基因，達到基因治療效果。中國科學院生物化學與細胞生物學研究所李勁松研究組通過在小鼠胚胎中注射CRISPR/Cas9糾正白內障小鼠模型中的遺傳缺陷，所產生的後代是可育的並能將修正後的等位基因傳遞給它們的後代。杜氏肌營養不良（DMD）是一種罕見的肌肉萎縮症，也是最常見的致命性遺傳病之一，是由肌營養不良蛋白dystrophin基因突變引起。杜克大學Charles Gersbach研究組應用CRISPR/Cas9在DMD小鼠中將dystrophin基因突變的23外顯子剪切，而合成了一個截短的但功能很強的抗肌萎縮蛋白，這是生物學家「首次成功地利用CRISPR基因編輯技術治癒了一隻成年活體哺乳動物的遺傳疾病」。

►CAR-T治療簡圖，圖片來自onclive.com

基因編輯技術聯合免疫療法在腫瘤及HIV/AIDS治療具有廣泛的應用前景。嵌合抗原受體T細胞（Chimeric Antigen Receptor T cell，CAR-T）細胞治療是非常有前景的腫瘤治療方法。CAR-T細胞療法在B細胞惡性血液腫瘤治療中已經取得碩果。中科院動物研究所王皓毅研究組利用CRISPR/Cas9技術在CAR-T細胞中進行雙基因（TCRα subunit constant 和beta-2 microglobulin）或三基因（TRAC，B2M及programmed death-1）敲除。美國斯隆凱特林癌症紀念中心Michel Sadelain研究組發現CRISPR/Cas9技術將CAR基因特異性靶向插入到細胞的TRAC基因座位點，極大增強了T細胞效力，編輯的細胞大大優於傳統在急性淋巴細胞白血病小鼠模型中產生CAR-T細胞。

繼諾華的Kymriah以及Gilead （kite Pharma）的Yescarta接連上市，CRISPR Therapeutics公司也在應用CRISPR/Cas9基因編輯技術開發同種異體CAR-T候選產品。2016年10月，四川大學華西醫院的腫瘤醫生盧鈾領導的一個團隊首次在人體中開展CRISPR試驗，從晚期非小細胞肺癌患者體內提取出免疫細胞，再利用CRISPR/Cas9技術剔除細胞中的PD-1基因更有助於激活T細胞去攻擊腫瘤細胞，最後將基因編輯過的細胞重新注入患者體內。

微生物種群與人體醫學，自然環境息息相關。北卡羅來納大學Rodolphe Barrangou與Chase L. Beisel合作通過使用基因組靶向CRISPR/Cas9系統可靶向並區分高度密切相關的微生物，並程序性去除細菌菌株，意味著CRISPR/Cas9系統可開發成精細微生物治療體系來剔除有害致病菌，人類將有可能精確控制微生物群體的組成。以色列特拉維夫大學Udi Qimron將CRISPR系統導入溫和噬菌體中在侵染具有抗生素抗性的細菌以消滅此類細菌，CRISPR系統已具有成為新一類抗生素的潛力。Locus BioSciences公司也在開發在噬菌體中開發CRISPR系統以達消滅難辨梭菌的目的。

弗吉尼亞理工大學Zhijian Tu研究組在雄蚊子中進行M因子基因編輯，可以導致雌雄蚊之間的轉化或雌蚊的殺戮，從而實現有效的性別分離和有效減少蚊子的數量，也將減少寨卡病毒及瘧疾等傳播。

基於CRISPR治療不僅可以應用於根除共生菌或有益菌群的病原體，也可應用於靶向人類病毒，包括HIV-1，皰疹病毒，乳頭瘤病毒及乙型肝炎病毒等。具有純合的32-bp缺失（Δ32）的CC趨化因子受體5型（CCR5）基因的患者對HIV感染具有抗性。因此加利福尼亞大學Yuet Wai Kan在誘導多能幹細胞iPSC中利用CRISPR系統引入純合CCR5Δ32突變後，誘導分化後的單核細胞和巨噬細胞對HIV感染具有抗性。天普大學Kamel Khalili 課題組應用CRISPR/Cas9系統在宿主細胞基因組中精確編輯HIV-1 LTR U3區，從而在將艾滋病病毒從基因組中剔除。

Cas12a （Cpf1）屬於CRISPR家族另一核酸內切酶，它也可被gRNA引導並剪切DNA。但是，它不僅可以切割相結合的單鏈或雙鏈DNA，也剪切其他的DNA。近日，加州大學伯克利分校Jennifer Doudna研究組開發了基於CRISPR的一項新技能——基因偵探（DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter (DETECTR)）。利用單鏈DNA將熒光分子和淬滅分子連接構建成一個報告系統，當CRISPR-Cas12a在gRNA引導下結合到目標DNA並發揮剪切作用時，報告系統中的DNA也被剪切，熒光分子將被解除抑制。此系統在致癌性HPV的人的DNA樣品檢測HPV16和HPV18變現極佳。

布羅德研究所Feng Zhang研究組開發的基於CRISPR的2代SHERLOCK （Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing），原理是利用Cas13a被激活後，可以切割除靶序列外其他的RNA的特徵，引入了解除熒光分子的抑制。此工具可實現一次性多重核酸檢測，可同時檢測4種靶標分子，額外添加的Csm6使得這種工具比它的前身具有更高的靈敏度，並將它開發成微型試紙條檢測方法，簡單明了易操作，已被研究人員成功應用於RNA病毒，如登革熱病毒和寨卡病毒，及人體液樣本檢測。

Broad研究所David R. Liu研究組利用CRISPR/Cas9開發了一種被稱為CAMERA（CRISPR-mediated analog multi-event recording apparatus）的記錄細胞事件的「黑匣子」他們利用這個系統開發出兩種細胞記錄系統，在第一種被稱為「CAMERA 1」的細胞記錄系統中，研究人員利用細菌中質粒的自我復制但又嚴格控制其自身數量的特徵，

將兩種彼此之間略有不同的質粒以穩定的比例轉化到細菌中，隨後在接觸到外來葯物刺激時，利用CRISPR/Cas9對這兩種質粒中的一種進行切割，通過對質粒進行測序並記錄兩種質粒比例的變化來記錄細菌接觸外來刺激的時間。另一種細胞記錄系統被稱為「CAMERA 2」，它利用基於CRISPR/Cas9的鹼基編輯系統實現在細胞內特定信號發生時改變遺傳序列中的單個鹼基，以此實現對諸如感染病毒、接觸營養物等刺激的記錄。這套技術的出現將很大程度的幫助人們進一步了解細胞的各類生命活動的發生發展規律。

2015 年 4 月，中山大學的黃軍利用CRISPR/Cas9介導的基因編輯技術，同源重組修復了胚胎中一個引發地中海貧血β-globin gene （HBB）的突變。

►圖片來自kurzgesagt.org

2016年，廣州醫科大學的范勇團隊在三原核受精卵中，應用基因編輯技術CRISPR受精卵中的基因CCR5進行編輯引入CCR5Δ32純合突變由於當時脫靶效率問題突出，產生了鑲嵌式的受精卵。

2017年8月2日，俄勒岡健康與科學大學胚胎細胞和基因治療中心Shoukhrat Mitalipov研究組公布了其應用CRISPR在人類胚胎中進行DNA編輯的結果，糾正了突變的MYBPC3基因，其突變會引起心肌肥厚並將年輕運動員猝死。

9. 請問什麼是基因編輯，如何編輯

"公眾對轉基因擔心的並不是基因技術，關鍵是轉基因的「轉」，現在通過基因測序研究已發展出基因編輯技術，可根據需要對原來的基因進行重新編輯，它可以不轉任何新的基因，也能產生很好效果。中國今後將在進一步開展轉基因研究的同時，積極推動基因編輯技術研究"。大媽連基因編輯都知道，真是厲害啊。既然提到這個，我就來科普一下啦。這個技術被Science期刊列為2013年十大突破中的第二位。導引RNA-Cas9系統是目前最簡單有效的基因編輯方法。這個系統本身最初是受細菌抵抗噬菌體的啟發。理論上你可以合成跟任何基因的DNA互補的導引RNA，這個RNA通過DNA-RNA序列互補（鹼基配對），把核酸酶Cas9定位到目標基因，然後Cas9利用它的核酸酶活性把目標基因在特定的部位切斷。之後，細胞自身的DNA損傷修復機制可以被用來改變目標基因Cas9切割點附近的DNA序列。這個系統可以用來選擇性剔除某個基因，控制目標基因的轉錄活性，甚至有可能用來糾正導致遺傳性疾病的突變基因。可是說到底，這個系統還是需要導入外源蛋白Cas9（最常用的是來自鏈球菌的Cas9)。另外，基因編輯只是對內源（原有）基因的修飾，而作物之所以需要轉基因，常常是因為它們的內源基因裡面沒有包括編碼某些有益性狀的基因。如果要把內源的某個基因就地變成一個新的基因，即使技術上可以做到，帶來的壞處也很可能超過好處（當然在特定條件下可能有例外），因為這個基因就會失去了原來該有的功能。當然，在有的情況下，可以利用基因編輯技術改變基因組裡面某些基因的表達水平，就可以加強某些有益的性狀和減弱某些有害性狀。總之反轉跟信教一樣，是一種思維定式，基本上無解，不是技術手段可以解決的問題。