引物設計時終止密碼子加在哪裡

Ⅰ 起始密碼子終止密碼子,啟動子,終止子,內含子,外顯子在什麼分子上

起始密碼子和終止密碼子在mRNA上，與翻譯有關。
啟動子和終止子分別在基因（DNA）的首端和尾端，與轉錄有關。
內含子和外顯子在真核生物基因的編碼區中，內含子沒有編碼蛋白質功能，外顯子有編碼蛋白質功能。

Ⅱ pcr引物設計的基本原則有哪些

PCR引物設計的11條黃金法則

1.引物最好在模板cDNA的保守區內設計。 DNA序列的保守區是通過物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟體（比如DNAman）比對（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區。

2.引物長度一般在15~30鹼基之間。 引物長度（primerlength）常用的是18-27bp，但不應大於38，因為過長會導致其延伸溫度大於74℃，不適於TaqDNA聚合酶進行反應。

3.引物GC含量在40%~60%之間，Tm值最好接近72℃。 GC含量（composition）過高或過低都不利於引發反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動溫度，一般高於Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使復性條件最佳。

4.引物3′端要避開密碼子的第3位。 如擴增編碼區域，引物3′端不要終止於密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發生簡並，會影響擴增的特異性與效率。

5.引物3′端不能選擇A，最好選擇T。 引物3′端錯配時，不同鹼基引發效率存在著很大的差異，當末位的鹼基為A時，即使在錯配的情況下，也能有引發鏈的合成，而當末位鏈為T時，錯配的引發效率大大降低，G、C錯配的引發效率介於A、T之間，所以3′端最好選擇T。

6.鹼基要隨機分布。引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3』端相似性較高的列，否則容易導致錯誤引發（Falsepriming）。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種鹼基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應超過3個連續的G或C，因這樣會使引物在GC富集序列區錯誤引發。

7.引物自身及引物之間不應存在互補序列。引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發夾結構（Hairpin）使引物本身復性。這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。引物自身不能有連續4個鹼基的互補。兩引物之間也不應具有互補性，尤其應避免3′端的互補重疊以防止引物二聚體（Dimer與Crossdimer）的形成。引物之間不能有連續4個鹼基的互補。引物二聚體及發夾結構如果不可避免的話，應盡量使其△G值不要過高（應小於4.5kcal/mol）。否則易導致產生引物二聚體帶，並且降低引物有效濃度而使PCR反應不能正常進行。

8.引物5′端和中間△G值應該相對較高，而3′端△G值較低。 △G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結構內部鹼基對的相對穩定性，△G值越大，則雙鏈越穩定。應當選用5′端和中間△G值相對較高，而3′端△G值較低（絕對值不超過9）的引物。引物3′端的△G值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構並引發DNA聚合反應。（不同位置的△G值可以用Oligo6軟體進行分析）

9.引物的5′端可以修飾，而3′端不可修飾。 引物的5′端決定著PCR產物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5′端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質結合DNA序列；引入點突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動子序列等。引物的延伸是從3′端開始的，不能進行任何修飾。3′端也不能有形成任何二級結構可能。

10.擴增產物的單鏈不能形成二級結構。某些引物無效的主要原因是擴增產物單鏈二級結構的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結構區域。用有關軟體（比如RNAstructure）可以預測估計mRNA的穩定二級結構，有助於選擇模板。實驗表明，待擴區域自由能（△G°）小於58.6lkJ/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區域時，用7-deaza-2′-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。

11.引物應具有特異性。 引物設計完成以後，應對其進行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補性，就可以進行下一步的實驗了。

Ⅲ 我們有一個質粒，他含有終止密碼子，教授要我對其設計引物然後做PCR，並對PCR產物進行雙酶切，但我不知道

在你PCR引物上正向和反向序列前各添加一個酶切位點（既然是雙酶切那這兩個酶應該不一樣，同時注意移碼的問題，且這兩個酶切位點是你要用的載體上也存在的，而已擴增的目的片段里沒有）。pcr後連T載體再酶切回收。同時用同樣的酶對你的載體酶切並回收，再將兩者相連。
你說到的去除終止密碼子，應該是指的你的目的片段上的，你可以在設計引物的時候將基因的最後三個鹼基去掉直接加酶切位點就可以將其去除了

Ⅳ 原核生物引物設計his標簽設計原則

如果你的蛋白可以用親和層析等非His tag的辦法進行純化，而且在原核裡面表達後具備親和層析的活性，就可以不用融合表達。但這時候你需要換載體或對原載體進行改造。因為N端的tag是必須帶在你蛋白N端的（如果用pET32a的話）。當然N端的tag帶上沒壞處，就是需要買EK酶（有點貴）。還需要在純化後再過一次柱子。
如果你不用後面的His標簽，你需要在你的目的基因上加上終止密碼子。
如果需要後面的His標簽，你需要加2個核酸進行移框得到His，而非Pro.
3. 不用在引物上另外再加His標簽了。