ssc溶液如何配置

Ⅰ 請問：ssc 緩沖液的 配方！有誰配置過嗎

-----------------配方(20x ssc)~~-------------

氯化鈉3M(175 g/liter)
檸檬酸鈉0.3 M(88 g/liter)

-----------------程序(20x ssc)---------------
3 M NaCl (175 g/liter)

0.3 M Na3citrate·2H2O (88 g/liter)

Adjust pH to 7.0 with 1 M HCl.

先加3M的氯化鈉

再加0.3M的檸檬酸鈉

最後用1M鹽酸把pH調整到7.0

-----------------為什麼?----------------

用這個可以出來的阿
pH=PKa+log10( [A-]/[HA])

檸檬酸鈉:弱酸
氯化鈉:共軛鹼

弱酸+ 共軛鹼= 緩沖劑!~~~

Ⅱ 硝酸纖維素膜NC膜的應用舉例

1.分子雜交
雜交技術有固相雜交和液相雜交之分。固相雜交技術目前較為常用，先將待測核酸結合到一定的固相支持物上，再與液相中的標記探針進行雜交。固相支持物常用硝酸纖維素膜。
固相雜交包括膜上印跡雜交和原位雜交。前者包括三個基本過程：第一，通過印跡技術將核酸片段轉移到固相支持物上；第二，用標記探針與支持物上的核酸片段進行雜交；第三，雜交信號的檢測。
用探針對細胞或組織切片中的核酸雜交並進行檢測的方法稱之為核酸原位雜交。某特點是靶分子固定在細胞中，細胞固定在載玻片上，以固定的細胞代替純化的核酸，然後將載玻片浸入溶有探針的溶液里，探針進入組織細胞與靶分子雜交，而靶分子仍固定在細胞內。例如。可用特異性的細菌、病毒的核酸做為探針對組織、細胞進行原位雜交，以確定有無該病原體的感染等。原位雜交不需從組織中提取核酸，對於組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性，在臨床應用上有獨特的意義。下面以放射性標記探針與固定在NC膜上的核酸進行雜交為例，雜交反應操作如下：
① 配製所需試劑
SSC溶液(20×)：3mol/L NaCl，0.3mol/L檸檬酸鈉。
Denhardt』s溶液(50×)：聚蔗糖5g，聚乙烯吡咯烷酮5g，牛血清白蛋白(BSA)5g加水至500ml。
預雜交液：6×SSC，5×Denhardt』s溶液，0.5%SDS，100?g/ml經變性或斷裂成片段的鮭精DNA。
② 將含靶核酸的NC膜漂浮於6×SSC液面，使其由下至上完全濕潤，並繼續浸泡2分鍾。
③ 將濕潤NC膜裝入塑料袋中，按0.2ml/cm2的量加入預雜交液，盡可能擠出氣泡，將袋封口，置68℃水浴1-2小時或過夜。
④ 將雙鏈探針做變性處理使成單鏈，即於100℃加熱5分鍾，然後立即置冰浴使驟冷。
⑤ 從水浴中取出雜交袋，剪去一角，將單鏈探針加入，盡可能將袋內空氣擠出去，重新封口，並將雜交袋裝入另一個干凈的袋內，封閉，以防放射性污染。
⑥ 將雜交袋浸入68℃水浴，溫育8-16小時。
⑦ 取出雜交袋，剪開，取出濾膜迅速浸泡於大量2×SSC和0.5%SDS中，室溫振盪5分鍾，勿使濾膜乾燥。
⑧ 將NC膜移入盛有大量2×SSC和0.1%SDS溶液的容器中，室溫漂洗15分鍾。
⑨ 將NC膜移入一盛有大量0.1×SSC和0.5%SDS溶液的容器中，37℃漂洗30分鍾至1小時。
⑩ 將NC膜移入一盛有新配0.1×SSC和0.5%SDS溶液的容器中，68℃漂洗30分鍾至1小時。
⑾ 取出濾膜，用0.1×SSC室溫稍稍漂洗，然後置濾紙上吸去大部分液體，待做雜交信號的檢測。

Ⅲ 那位高人知道SSC溶液具體的成分和作用原理啊

SSC（saline sodium citrate）緩沖溶液是分子生物學中最標準的印跡和雜交處理溶液，其含有Sodium Chloride，Sodium Citrate，Trizma Base等成分。

20倍SSC分子生物級濃縮緩沖溶液是一種旨在用於各種雜交實驗達到變性和清洗的常用濃縮型緩沖液（pH 7.2）

Ⅳ dot blot 中ssc是什麼

SSC是核酸雜交中常用的緩沖液名稱，在很多地方都可以查到配製方法。
20X SSC比較常用的配製方法：
配製量： 1L
配製方法：
1.准確稱取175.2g氯化鈉。
2.准確稱取88.2g檸檬酸鈉。
3.溶解於800mL去離子水中。
4.加入數滴10mol/L氫氧化鈉溶液調節pH值至7.0。
5.加去離子水定容至1L。
注意：按實驗需要可分裝後高壓滅菌。10×SSC、5×SSC、1×SSC可由20×SSC做相應稀釋得到。

http://ask.bbioo.com/show/586.htm

Ⅳ 如何從細胞中提取dna

提取基因組DNA和細胞核DNA是不同的方法
提取細胞核要先把細胞破碎分離出細胞核，要在甘油或其他保護劑中進行
SDS十二烷基磺酸鈉：可破壞細胞膜、核膜，並使組織蛋白與DNA分離
CATB是一種抽提液，破壞細胞膜的~具體忘了~
DNA不溶於異丙醇，異丙醇可以析出DNA，產生白色絮狀沉澱，用槍頭挑出就可以了
以下是一些具體方法，希望有用
基因組DNA提取方法

制備基因組DNA是進行基因結構和功能研究的重要步驟，通常要求得到的片段的長度不小於100-200kb。在DNA提取過程中應盡量避免使DNA斷裂和降解的各種因素，以保證DNA的完整性，為後續的實驗打下基礎。主要是CTAB方法，其他的方法還有1物理方式:玻璃珠法,超聲波法,研磨法,凍融法。2化學方式：異硫氰酸胍法,鹼裂解法3生物方式:酶法。根據核酸分離純化方式的不同有:硅質材料、陰離子交換樹脂等

試驗步驟：

1、貼壁細胞用胰酶消化，離心收集。

2、細胞重懸於冰冷的PBS漂洗一次，離心收集。試驗步驟2再重新作一邊。

3、加入5mlDNA提取緩沖液，(10mmol/LTris-cl,0.1mol/LEDTA,o.5%SDS),混勻。

4、加入25ul蛋白酶K,使終濃度達到100ug/ml,混勻，50℃水浴3h,

5、用等體積的酚抽提一次，2500rpm離心收集水相，用等體積的（酚，氯仿，異戊醇）混合物抽提一次，2500r/min離心收集水相

6、用等體積的氯仿，異戊醇抽提一次。加入等體積的5mol/L的LiCL,混勻，冰浴，10min.。

7、2500rpm離心10min.轉上清於一離心管中。加入等體積的異丙醇。室溫10min。

2500rpm,離心10min。棄上清。

8、加入0.1倍體積3mol/L乙酸鈉(PH5.2)與2倍體積-20℃預冷無水乙醇。-20℃20min。

9、12000r/min,室溫離心5min。棄上清。將DNA溶於適量TE中。

外周血DNA提取技術

分離外周血白細胞提取方法：

試驗步驟：

1、取人肘靜脈血5ml，EDTA抗凝，2500rpm離心10min。

2、小心吸取上層血漿，分裝到3個0.5ml離心管中。

3、在血細胞中加入3倍體積的溶血液，搖勻，冰浴15min。

4、2500rpm離心10min，棄上清。

5、加入10ml溶血液，搖勻，冰浴15min。

6、3000rpm離心10min，棄上清。

7、倒置離心管，去掉殘液。

8、得白細胞，－80?C凍存。

試驗要求：

血至分離白細胞之間隔時間在室溫下放置不超過2h，4℃放置不超過5h，以防白細胞自溶。

氯仿法抽提外周血白細胞基因組DNA：

試驗試劑：

Ligsisbuffer：

133mMNH4ClNHCl7.12g0.9mMNH4HCO3NH4HCO30.071g0.1mMEDTA0.5mMEDTA0.2ml；最後加滅菌去離子水至1000ml，高壓滅菌。

ACD抗凝劑：檸檬酸1.68g檸檬酸鈉4.62g葡萄糖5.15g；最後加滅菌去離子水至350ml，高壓滅菌。

提取緩沖液（Extractionbuffer）：

10mMTrisCl(PH=8.0)1MTris.Cl(PH=8.0)1ml0.1mMEDTA(PH=8.0)0.5mMEDTA(PH=8.0)20ml0.5%SDS10%SDS0.5ml；最後加滅菌去離子水至100ml，高壓滅菌

試驗步驟：

1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl，充分顛混至清亮。以4000rpm，離心5min。棄上清液。

2、沉澱中加入ligsisbuffer1500μl，充分勻漿。以6000rpm，離心5min。

3、徹底棄去上清，加入extractionbuffer500μl（裂解細胞），混勻置於37℃，水溶1h。

4、加入8μl的蛋白酶K，顛混，37℃過夜（或55℃，3h，但是37℃效果要好些）。

5、每管加入450μl飽和酚（取溶液下層）緩慢搖晃10min，以5500rpm，離心15min。

6、取上清，每管加入250μl飽和酚和250μl氯仿－異戊醇，搖勻10min，以5500rpm，離心15min。

7、取上清，每管加入500μl氯仿－異戊醇，搖勻10min，以5500rpm，離心15min。

8、取上清，每管加50μl的3M的NaAC＋，適量無水乙醇（預冷）至滿，搖勻放入-20℃保存2h以上。

9、以12000rpm，離心20min。去上清，加入70％乙醇500μl，以12000rpm，離心5min，去上清，50－60℃乾燥。

10、加入50μl滅菌去離子水，轉彈，混勻。

NaI提取法提取外周血白細胞基因組：

實驗步驟：

1、取外周抗凝血（全血）100ul於eppendorf管中，12000rpm離心12min。

2、棄上清，加雙蒸水200ul溶解，搖勻20s。

3、混勻後加6MNaI溶液200ul，搖勻20s。

4、加入氯仿/異戊醇（24：1）400ul，邊加邊搖，搖勻20s，12000rpm離心12min。

5、取上層液350ul，加入另一新eppendorf管中，加0.6倍體積異丙醇，搖勻20s，室溫放置15min，靜置後的反應體系15000rpm離心12min，使沉澱緊貼eppendorf管壁。

6、棄異丙醇，加70％乙醇1ml（不振動），以15000rpm離心12min。

7、棄乙醇，敞開eppendorf管蓋，烘乾（37℃恆溫箱）後，加1xTE溶液30ul，溶解DNA＞12h以上，製成的DNA液-20℃冰箱保存備用。

常用的外周血白細胞基因提取方法：

試驗原理：

苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白質的變性劑，反復抽提，使蛋白質變性，SDS(十二烷基磺酸鈉)將細胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白質或多肽或小肽分子，核蛋白變性降解，使DNA從核蛋白中游離出來。DNA易溶於水，不溶於有機溶劑。蛋白質分子表面帶有親水基團，也容易進行水合作用，並在表面形成一層水化層，使蛋白質分子能順利地進入到水溶液中形成穩定的膠體溶液。當有機溶液存在時，蛋白質的這種膠體穩定性遭到破壞，變性沉澱。離心後有機溶劑在試管底層(有機相)，DNA存在於上層水相中，蛋白質則沉澱於兩相之間。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白質。氯仿的作用是有助於水相與有機相分離和除去DNA溶液中的酚。抽提後的DNA溶液用2倍體積的無水乙醇在1/103mol/LNaCl存在下沉澱DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉澱中的鹽，真空乾燥，用TE緩沖液溶解DNA備用。

試驗步驟：

1、將1mlEDTA抗凝貯凍血液於室溫解凍後移入5ml離心管中，加入1ml磷酸緩沖鹽溶液（PBS），混勻，3500rpm離心15min,傾去含裂解紅細胞的上清。重復一次。用0.7mlDNA提取液混懸白細胞沉澱，37℃水浴溫育1h。

2、將上述DNA提取液混懸白細胞，37℃水浴溫育1h後，加入1mg/ml蛋白酶K0.2ml,至終濃度為100-200ug/ml,上下轉動混勻，液體變粘稠。50℃水浴保溫3h，裂解細胞，消化蛋白。保溫過程中，應不時上下轉動幾次，混勻反應液。

3、反應液冷卻至室溫後，加入等體積的飽和酚溶液，溫和地上下轉動離心管5-10min，直至水相與酚相混勻成乳狀液。5000rpm離心15min，用大口吸管小心吸取上層粘稠水相，移至另一離心管中。重復酚抽提一次。加等體積的氯仿：異戊醇（24：1），上下轉動混勻，5000rpm離心15min，用大口吸管小心吸取上層粘稠水相，移至另一離心管中。重復一次。

4、加入1/5體積的3mol/LNaAc及2倍體積的預冷的無水乙醇，室溫下慢慢搖動離心管，即有乳白色雲絮狀DNA出現。用玻璃棒小心挑取雲絮狀的DNA，轉入另一1.5ml離心管中，加70%乙醇0.2ml，以5000rpm離心5min。洗滌DNA，棄上清，去除殘留的鹽。重復一次。室溫揮發殘留的乙醇，但不要讓DNA完全乾燥。加TE液20ul溶解DNA,置於搖床平台緩慢搖動，DNA完全溶解通常需12-24h。製成的DNA液-20℃冰箱保存備用。

真核細胞DNA的制備

一般真核細胞基因組DNA有107-9bp，可以從新鮮組織、培養細胞或低溫保存的組織細胞中提取，常是採用在EDTA以及SDS等試劑存在下用蛋白酶K消化細胞，隨後用酚抽提而實現的。這一方法獲得的DNA不僅經酶切後可用於Southern分析，還可用於PCR的模板、文庫構建等實驗。

根據材料來源不同，採取不同的材料處理方法，而後的DNA提取方法大體類似，但都應考慮以下兩個原則：

1、防止和抑制DNase對DNA的降解。

2、盡量減少對溶液中DNA的機械剪切破壞。

試劑准備：

1、TE:10mMTris-HCl(pH7.8);1mMEDTA(pH8.0)。

2、TBS:25mMTris-HCl(pH7.4);200mMNaCl;5mMKCl。

3、裂解緩沖液：250mMSDS;使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。

4、20%SDS

5、2mg/ml蛋白酶K

6、Tris飽和酚（pH8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿

7、無水乙醇、75%乙醇

試驗步驟：

材料處理：

1、新鮮或冰凍組織處理：

1)取組織塊0.3-0.5cm3,剪碎，加TE0.5ml，轉移到勻漿器中勻漿。

2)將勻漿液轉移到1.5ml離心管中。

3)加20%SDS25ml，蛋白酶K(2mg/ml)25ml，混勻。

4)60°C水浴1-3hr。

2、培養細胞處理：

1)將培養細胞懸浮後，用TBS洗滌一次。

2)離心4000g×5min，去除上清液。

3)加10倍體積的裂解緩沖液。

4)50-55°C水浴1-2hr。

DNA提取：

1、加等體積飽和酚至上述樣品處理液中，溫和、充分混勻3min。

2、離心5000g×10min，取上層水相到另一1.5ml離心管中。

3、加等體積飽和酚，混勻，離心5000g×10min，取上層水相到另一管中。

4、加等體積酚/氯仿，輕輕混勻，離心5000g×10min，取上層水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重復此步驟數次。

5、加等體積氯仿，輕輕混勻，離心5000g×10min，取上層水相到另一管中。

6、加1/10體積的3M醋酸鈉（pH5.2）和2.5倍體積的無水乙醇，輕輕倒置混勻。

7、待絮狀物出現後，離心5000g×5min，棄上清液。

8、沉澱用75%乙醇洗滌，離心5000g×3min，棄上清液。

9、室溫下揮發乙醇，待沉澱將近透明後加50-100mlTE溶解過夜。

植物組織中DNA的提取

試驗原理：

脫氧核糖核酸（deoxribonucleicacid，DNA）是一切生物細胞的重要組成成分，主要存在於細胞核中，鹽溶法是提取DNA的常規技術之一。從細胞中分離得到的DNA是與蛋白質結合的DNA，其中還含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地將這兩種核蛋白分開是技術的關鍵。DNA不溶於0.14mol/L的NaCl溶液中，而RNA則能溶於0.14mol/L的NaCl溶液之中，利用這一性質就可以將二者從破碎細胞漿液中分開。制備過程中，細胞破碎的同時就有Dnase釋放到提取液中，使DNA因被降解而影響得率，在提取緩沖液中加入適量的檸檬酸鹽和EDTA，既可抑制酶的活性又可使蛋白質變性而與核酸分離，再加入陰離子去垢劑0.15％的SDS，經過2h攪拌，或用氯仿－異醇除去蛋白，通過離心使蛋白質沉澱而除去，得到的是含有核酸的上清液。然後用95％的預冷乙醇即可把DNA從除去蛋白質的提取液中沉澱出來。

植物DNA的SDS提取法：

試驗試劑：

1、研磨緩沖液：稱取59.63gNaCl，13.25g檸檬酸三鈉，37.2gEDTA－Na分別溶解後合並為一，用0.2mol/L的NaOH調至pH7.0，並定容至1000ml。

2、10×SSC溶液：稱取87.66gNaCl和44.12g檸檬酸三鈉，分別溶解，一起定容至1000ml。

3、1×SSC溶液：用10×SSC溶液稀釋10倍。

4、0.1×SSC溶液：用1×SSC溶液稀釋10倍。

5、Rnase溶液：用0.14mol/LNaCl溶液配製成25mg/ml的酶液，用1mol/LHCl，pH至5.0，使用前經80℃水浴處理5min（以破壞可能存在的Dnase）。

6、氯仿－異戊醇：按24ml氯仿和1ml異戊醇混合。

7、5mol/L高氯酸鈉溶液：稱取NaClO4．H2O70.23g，先加入少量蒸餾水溶解再容至100ml。

8、SDS（十二烷基硫酸鈉）化學試劑的重結晶：將SDS放入無水酒精中達到飽和為止，然後在70～80℃的水浴中溶解，趁熱過濾，冷卻之後即將濾液放入冰箱，待結晶出現再置室溫下涼干待用。

9、1mol／LHCl。

10、0.2mol/LNaOH。

11、二苯胺乙醛試劑：1.5g二苯胺溶於100ml冰醋酸中，添加1.5ml濃硫酸，裝入棕色瓶，貯存暗處，使用時加0.1ml乙醛液〔濃乙醛：H2O＝1：50（V／V）〕。

12、1.0mol/L高酸溶液（HClO4）。

13、0.05mol/LNaOH。

14、DNA標准液：取標准DNA25mg溶於少量0.05mol.L-1NaOH中，再用0.05mol/LNaOH定容至25ml，後用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加5.0ml1mol/LHClO4，混合冷卻後用0.5mol/LHClO4定容至刻度，則得100μg/ml的標准溶液。

實驗步驟：

1、稱取植物幼嫩組織10g剪碎置研缽中，加10ml預冷研磨緩沖液並加入0.1g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊狀。

2、將勻漿無損轉入25ml刻度試管中加入等體積的氯仿－異戊醇混合液，加上塞子，劇烈振盪30s，轉入離心管，靜置片刻以脫除組織蛋白質。以4000rpm離心5min。

3、離心形成三層，小心地吸取上層清液至刻度試管中，棄去中間層的細胞碎片、變性蛋白質及下層的氯仿。

4、將試管置72℃水浴中保溫3min（不超過4min），以滅活組織的DNA酶，然後迅速取出試管置冰水浴中冷卻到室溫，加5mol/L高氯酸鈉溶液〔提取液：高氯酸鈉溶液＝4：1（V／V）〕，使溶液中高氯酸鈉的最終濃度為1mol/L。

5、再次加入等體積氯仿－異戊醇混合液至大試管中，振盪1min，靜置後在室溫下離心（4000rpm）5min，取上清液置小燒杯中。

6、用滴管吸95％的預冷乙醇，慢慢地加入燒杯中上清液的表面上，直至乙醇的體積為上清液的兩倍，用玻璃棒輕輕攪動。此時核酸迅速以纖維狀沉澱纏繞在玻璃棒上。

7、然後加入0.5ml左右的10×SSC，使最終濃度為1×SSC。

8、重復第6步驟和第7步驟即得到DNA的粗製品。

9、加入已處理的Rnase溶液，使其最後的作用濃度為50～70μg/ml，並在37℃水浴中保溫30min，以除去RNA。

10、加入等體積的氯仿－異戊醇混合液，在三角瓶中振盪1min，再除去殘留蛋白質及所加Rnase蛋白，室溫下以4000rpm離心5min，收集上層水溶液。

11、再按6、7步驟處理即可得到純化的DNA液。

植物DNA的CTAB提取法：

試驗步驟：

1、稱取新鮮葉片2-3g，剪碎放入研缽中，在液氮中研磨成粉末。

2、將粉末轉移到加有7ml經預熱的15×CTAB提取緩沖液15ml離心管中，迅速混勻後置於65℃水浴中，溫育30min。

3、取出離心管,冷卻至室溫，加入氯仿/異戊醇(24:1)，充分混勻，室溫下2300轉離心20min。

4、將上清轉移至另一新的15ml離心管中，加入1/10體積10%的CTAB和等體積的氯仿/異戊醇。充分混勻，2300rpm離心20min。

5、轉移上清至另一新的15ml離心管中，加入等體積1%的CTAB沉澱緩沖液，輕輕搖晃至形成DNA絮狀沉澱。1000rpm離心10min，使DNA沉澱於管底。

6、加入1.5-2ml的1mol/LNaCl及5μlRNase置於56℃水浴中過夜。

7、待DNA完全溶解後，加2-3ml4℃預冷的95%的冰乙醇使DNA沉澱，挑出DNA，置於15ml離心管中，用70%乙醇清洗30min。

8、離心機甩5s，倒出70%乙醇，再用95%乙醇浸泡5min，倒出95%乙醇，在超凈工作台上吹乾。

9、將風乾的DNA直接在4℃保存備用或溶於100μlTE溶液中於-20℃保存。

細菌DNA的提取方法

針對一些不易於提取的細菌的方法:

試驗試劑：

抽提緩沖液：2%CTAB(W/V)2%PVPK25(w/v)（去色素）100mMTris-HCl(pH8.0)

25mMEDTA(pH8.0)2.0MNaCl

10MLiCl

2MLiCl

DEPC-water（抑制RNA酶活性）

3MNaAc(pH5.2)

96%乙醇

70%乙醇

試驗步驟：

1、抽提緩沖液65℃預熱。

2、加菌體到已經預熱的緩沖液（700ul）中混勻，65℃，10min。

3、加酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），振盪，以12,000rpm，離心10min。

4、取上清，加氯仿/異戊醇（24：1）振盪，以12,000rpm，離心10min。

5、重復再作一次步驟4。

6、加入1/10體積的3M醋酸鈉和1.5倍體積的乙醇（或加入等體積的異丙醇），－20C下沉澱。

7、以2,000rpm，離心10min。

8、棄上清，以70％乙醇條洗沉澱，也可以再用100％乙醇洗，然後溶解於100ml水中。

較為常用的細菌DNA提取方法：

實驗步驟：

1、將菌株接種於液體LB培養基，37℃震盪培養過夜。

2、取1.5ml培養物12000rpm離心2min。

3、沉澱中加入567ul的TE緩沖液，反復吹打使之重新懸浮，加入30ul10%SDS和15ul的蛋白酶K，混勻，於37℃溫育1h.

4、加入100ul5mol/LNaCl,充分混勻，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混勻後再65℃溫育10min。

5、加入等體積的酚/氯仿/異戊醇混勻，離心4-5min,將上清轉入一隻新管中，加入0.6-0.8倍體積的異丙醇，輕輕混合直到DNA沉澱下來，沉澱可稍加離心。

6、沉澱用1ml的70%乙醇洗滌後，離心棄乙醇．

真菌DNA提取總結的兩種方法：

第一種方法：

試驗步驟：

1、取真菌菌絲0.5g,在液氮中迅速研磨成粉。

2、加入4mL提取液，快速振盪混勻。

3、加入等體積的4mL的氯仿:異戊醇(24:1)，渦旋3～5min（此處是粗提沒有加酚）。

4、以4℃，1000rpm，離心5min。

5、上清再用等體積的氯仿:異戊醇(24:1)抽提一次。以4℃，10,000rpm，離心5min。

6、取上清，加入2/3倍體積的-20℃預冷的異丙醇或2.5倍體積的無水乙醇沉澱,混勻,靜置約30min。

7、用毛細玻棒挑出絮狀沉澱,用75%乙醇反復漂洗數次,再用無水乙醇漂洗1次,吹乾，重懸於500ulTE中。

8、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃下處理1h。

9、用酚（pH8.0）:氯仿:異戊醇(25:24:1)和氯仿:異戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10,000rpm，離心5min。

10、取上清，加入1/10倍體積的3MNaAc,2.5倍體積的無水乙醇,-70℃沉澱30min以上。

11、沉澱用75%乙醇漂洗，風干,溶於200ulTE中，-20℃保存備用。

DNA提取液：0.2MTris-HCl（pH7.5），0.5MNaCl，0.01MEDTA，1％SDS，3MNaAc。

第二種方法：

試驗步驟：

1、真菌菌絲0.5-1g,在液氮中迅速研磨成粉。

2、加入3mL65℃預熱的DNA提取緩沖液，快速振盪混勻65℃水浴30min,期間混勻2-3次。

3、加入1mL5MKAc，冰浴20min。

4、等體積的氯仿:異戊醇(24:1)抽提1次（10,000rpm，4℃離心5min）。

5、取上清，加入2/3倍體積的-20℃預冷異丙醇,混勻,靜置約30min。

6、用毛細玻棒挑出絮狀沉澱,用75%乙醇反復漂洗數次,再用無水乙醇漂洗1次,吹乾，重懸於500ulTE中。

7、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃處理1h。

8、用酚（pH8.0）:氯仿:異戊醇(25:24:1)和氯仿:異戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10,000rpm，離心5min。

9、取上清，1/10V3MNaAc,2.5V體積的無水乙醇,-70℃沉澱30min以上。

10、沉澱用75%乙醇漂洗，風干,溶於200ulTE中，-20℃保存備用。
植物基因組提取(CATB法)
作者： 時間：2008-05-13 14:26:27 來源: 生物谷 瀏覽評論

一、實驗目的
掌握植物總DNA的抽提方法和基本原理。學習根據不同的植物和實驗要求設計和改良植物總DNA抽提方法。
二、實驗原理
通常採用機械研磨的方法破碎植物的組織和細胞，由於植物細胞勻漿含有多種酶類(尤其是氧化酶類)對DNA的抽提產生不利的影響，在抽提緩沖液中需加入抗氧化劑或強還原劑(如巰基乙醇)以降低這些酶類的活性。在液氮中研磨，材料易於破碎，並減少研磨過程中各種酶類的作用。
十二烷基肌酸鈉(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化銨(hexadyltrimethyl ammomum bromide，簡稱為CTAB)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，簡稱SDS)等離子型表面活性劑，能溶解細胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，從而使DNA得以游離出來。再加入苯酚和氯仿等有機溶劑，能使蛋白質變性，並使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很強，經離心後即可從抽提液中除去細胞碎片和大部分蛋白質。上清液中加入無水乙醇使DNA沉澱，沉澱DNA溶於TE溶液中，即得植物總DNA溶液。
三、實驗材料
水稻幼葉
四、主要配方
2% CTAB抽提緩沖溶液: CTAB 4g NaCl 16.364 g 1M Tris-HCl 20ml( PH8.0) 0.5M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml滅菌, 冷卻後0.2-1% 2-巰基乙醇 （400ul） 氯仿-異戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml異戊醇，搖勻即可。
五、實驗步驟
1. DNA的提取
（1） 2%CTAB抽提緩沖液在65℃水浴中預熱。
（2）取少量葉片（約1g）置於研缽中，用液氮磨至粉狀；
（3） 加入700ul的2%CTAB抽提緩沖液，輕輕攪動；
（4） 將磨碎液分倒入1.5 ml的滅菌中，磨碎液的高度約占管的三分之二；
（5）置於65℃的水浴槽或恆溫箱中，每隔10 min輕輕搖動，40 min後取出；
（6）冷卻2 min後，加入氯仿-異戊醇（24：1）至滿管，劇烈振盪2~3 min，使兩者混合均勻；
（7）放入離心機中10 000 rpm離心10 min，與此同時，將600 µl的異丙醇加入另一新的滅菌中；
（8） 10 000 rpm離心1 min後，移液器輕輕地吸取上清夜，轉入含有異丙醇的內，將離心管慢慢上下搖動30 sec，使異丙醇與水層充分混合至能見到DNA絮狀物；
（9）10000 rpm離心1 min後，立即倒掉液體，注意勿將白色DNA沉澱倒出，將離心管倒立於鋪開的紙巾上； （10）60 sec後，直立離心管，加入720 µl的75%乙醇及80 µl 5 M的醋酸鈉，輕輕轉動，用手指彈管尖，使沉澱與管底的DNA塊狀物浮游於液體中；
（11）放置30 min，使DNA塊狀物的不純物溶解；
（12）10000 rpm離心1 min後，倒掉液體，再加入800 µl 75%的乙醇，將DNA再洗 30 min；
（13）10000 rpm離心30 sec後，立即倒掉液體，將離心管倒立於鋪開的紙巾上；數分鍾後，直立離心管，乾燥DNA（自然風干或用風筒吹乾）；
（14）加入50 µl 0.5 × TE(含RNase)緩沖液，使DNA溶解，置於37℃恆溫箱約15 h，使RNA消解；
（15）置於-20℃保存、備用。
2. DNA質量檢測
瓊脂糖電泳檢測，原理和方法見實驗二。
六、 注意事項
（1）葉片磨得越細越好。
（2）移液器的使用。
（3）由於植物細胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作應迅速，以免組織解凍，導致細胞裂解，釋放出DNA酶，使DNA降解。

Ⅵ 熒光原位雜交會用到哪些試劑

一、 實驗材料、試劑、儀器耗材：

人的MyoD1（MYF3)基因探、人外周血中期染色體細胞標本

指甲油、甲醯胺、氯化鈉、檸檬酸鈉、氫氧化鈉、吐溫20等

恆溫水浴鍋、培養箱、染色缸、載玻片、Nikon E-400熒光顯微鏡、蓋玻片、封口膜、200μL移液器、暗盒等

二、相關溶液的配製

（1）20×SSC：175.3 g NaCl，88.2 g檸檬酸鈉，加水至1 000 mL（用10 mol/L NaOH調pH 至7.0）。

（2）去離子甲醯胺（DF）：將10 g混合床離子交換樹脂加入100 mL甲醯胺中。電磁攪拌30 min，用Whatman l號濾紙濾。

（3）體積分數70%甲醯胺/2×SSC：35 mL甲醯胺，5 mL 20×SSC，10 mL水。

（4）體積分數50%甲醯胺/2×SSC：100 mL甲醯胺，20 mL 20×SSC，80 mL水。

（5）體積分數50%硫酸葡聚糖（DS）：65℃水浴中融化，4℃或-20℃保存。

（6）雜交液：8 μL體積分數25%DS，20 μL 20×SSC混合。（或40 μL體積分數50% DS，20 μL 20×SSC，40

μL ddH2O混合）取上述混合液50 μL，與5 μL DF混合即成。其終濃度為體積分數10% DS，2×SSC，體積分數50% DF。

（7）PI/antifade溶液

PI原液：先以雙蒸水配置溶液，濃度為100 μg/mL，取出1 mL，加39 mL雙蒸水，使終濃度為2.5 μg/mL。

Antifade原液：以PBS緩沖液配製該溶液，使其濃度為10 mg/mL，用0.5 mmol/L的NaHCO3調pH值為8.0。取上述溶液1 mL，加9 mL甘油，混勻。

PI/antifade溶液：PI與antifade原液按體積比1:9比例充分混勻，－20℃保存備用。

（8）DAPI/antifade溶液：用去離子水配製1mL/mg DAPI儲存液，按體積比1:300，以antifade溶液稀釋成工作液。

（9）封閉液I：體積分數5% BSA 3 mL，20×SSC 1 mL，ddH2O 1mL，Tween20 5 μL混合。

（10）封閉液II：體積分數5% BSA 3mL，20×SSC 1mL，goat serum 250 μL，ddH2O 750 μL，Tween20 5 μL混合。

（11）熒光檢測試劑稀釋液：體積分數5% BSA 1mL，20×SSC 1mL，ddH2O 3mL，Tween20 5μL混合。

（12）洗脫液：100 mL 20×SSC，加水至500 mL，加Tween20 500 μL。

Ⅶ PH值為4.8的檸檬酸–檸檬酸鈉緩沖液怎麼配置

已知檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液pH公式為pH=pKa2+lg([檸檬酸鈉]/[檸檬酸])，查表檸檬酸PKa2=4.76，要配置pH=4.8的緩沖液，所以4.8=4.76+lg([檸檬酸鈉]/[檸檬酸])，即lg([檸檬酸鈉]/[檸檬酸])=0.04。

檸檬酸鈉與檸檬酸的物質量之比為1.0965，另外把所需要的緩沖液濃度(比如1mol/L)先設為Xmol/L帶入：即取用檸檬酸為192Xg，檸檬酸鈉為(294*1.0965*X)g。

假設配製一升0.05M 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液

pH = pKa2 + Log[摩爾(Na2HCit)/摩爾(NaH2Cit)]

4.5= 4。76 + Log[摩爾(Na2HCit)/摩爾(NaH2Cit)]

那麼

（1）[摩爾(NaH2Cit)/摩爾(Na2HCit)]=10^0.26

又，

（2）摩爾(Na2HCit)/摩爾(NaH2Cit)= 1 x 0.05 = 0.05 摩爾

解聯立方程組（1）和（2）可求出所需的：

摩爾(Na2HCit)/摩爾(NaH2Cit)

再乘以它們的分子量就得到所需的重量了。

(7)ssc溶液如何配置擴展閱讀：

檸檬酸鹽緩沖液在醫學詞彙中還縮寫為CPBS，PH=5.5，常用於免疫分析，如ELISA法，主要成分為檸檬酸和磷酸氫鈉。

在生化研究工作中，常常需要使用緩沖溶液來維持實驗體系的酸鹼度。研究工作的溶液體系pH值的變化往往直接影響到研究工作的成效。如果「提取酶」實驗體系的pH值變動或大幅度變動，酶活性就會下降甚至完全喪失。所以配製緩沖溶液是一個不可或缺的關鍵步驟。

Ⅷ 植物的基因怎樣提取

植物DNA提取方法

方法一：
1.取兩片幼嫩新鮮葉片，置於預冷的研缽中，倒入適量液氮，迅速研磨成粉末狀，隨後加入3ml預熱的2%CTAB抽提緩沖液和50ul抗氧化劑2-巰基乙醇，繼續研磨成略有流動性的糊狀或粥狀，轉入1.5ml的離心管中，於65℃水浴鍋中保溫約60min。
2.待混合物冷卻至室溫後加入等600ul的CI（氯仿：異戊醇=24：1）溶液混勻，輕輕顛倒離心管幾次使管內混合物成乳濁液，常溫下10000rpm離心10min,取上清液轉入另一干凈的離心管中。
3.重復步驟（2）一次。
4.取步驟（3）上清液加入2.5倍體積無水乙醇，仔細混勻，-20冰箱30min以上，沉澱DNA 4℃，12000rpm離心10min。
5.棄去上層有機溶劑，加500ul75%乙醇洗滌沉澱，4℃下8000rpm離心5min,棄去上清，洗滌沉澱3次。
6.倒置或者37度培養箱烘乾。
7.加50ulTE緩沖液溶解DNA，於-20℃冷藏備用。

方法二：
1. 在50ml離心管中加入20ml提取緩沖液Ⅰ, 60℃水浴預熱。
2. 植物5-10g, 剪碎, 在研缽中加液氮磨成粉狀後立即倒入預熱的離心管中, 劇烈搖動混勻, 60℃水浴保溫30-60分鍾(時間長,DNA產量高), 不時搖動。
3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 顛倒混勻(需帶手套, 防止損傷皮膚)，室溫下靜置5-10分鍾, 使水相和有機相分層(必要時可重新混勻)。
4. 室溫下5000rpm離心5分鍾。
5. 仔細移取上清液至另一50ml離心管,加入1倍體積異丙醇,混勻,室溫下放置片刻即出現絮狀DNA沉澱。
6. 在1.5mleppendorf中加入1ml TE。用鉤狀玻璃棒撈出DNA絮團,在干凈吸水紙上吸干,轉入含TE的離心管中,DNA很快溶解於TE。
7. 如DNA不形成絮狀沉澱,則可用5000rpm離心5分鍾, 再將沉澱移入TE管中。這樣收集的沉澱,往往難溶解於TE,可在60℃水浴放置15分鍾以上，以幫助溶解。
8. 將DNA溶液3000rpm離心5分鍾,上清液倒入干凈的5ml離心管。
9. 加入5μlRNaseA(10μg/μl), 37℃ 10分鍾, 除去RNA(RNA對DNA的操作、分析一般無影響，可省略該步驟）。
10. 加入1/10體積的3mol/L NaAc及2×體積的冰乙醇,混勻,-20℃放置20分鍾左右,DNA形成絮狀沉澱。
11. 用玻棒撈出DNA沉澱,70%乙醇漂洗,再在干凈吸水紙上吸干。
12. 將DNA重溶解於1ml TE, -20貯存。
13. 取2μlDNA樣品在0.7% Agarose膠上電泳, 檢測DNA的分子大小。同時取15μl稀釋20倍, 測定OD260/OD280, 檢測DNA含量及質量。

方法三：
植物DNA的SDS提取法：
試驗試劑：
1、研磨緩沖液：稱取59.63gNaCl，13.25g檸檬酸三鈉，37.2gEDTA－Na分別溶解後合並為一，用0.2mol/L的NaOH調至pH7.0，並定容至1000ml。
2、10×SSC溶液：稱取87.66gNaCl和44.12g檸檬酸三鈉，分別溶解，一起定容至1000ml。
3、1×SSC溶液：用10×SSC溶液稀釋10倍。
4、0.1×SSC溶液：用1×SSC溶液稀釋10倍。
5、Rnase溶液：用0.14mol/LNaCl溶液配製成25mg/ml的酶液，用1mol/LHCl，pH至5.0，使用前經80℃水浴處理5min（以破壞可能存在的Dnase）。
6、氯仿－異戊醇：按24ml氯仿和1ml異戊醇混合。
7、5mol/L高氯酸鈉溶液：稱取NaClO4·H2O 70.23g，先加入少量蒸餾水溶解再容至100ml。
8、SDS（十二烷基硫酸鈉）化學試劑的重結晶：將SDS放入無水酒精中達到飽和為止，然後在70～80℃的水浴中溶解，趁熱過濾，冷卻之後即將濾液放入冰箱，待結晶出現再置室溫下涼干待用。
9、1mol/LHCl。
10、0.2mol/LNaOH。
11、二苯胺乙醛試劑：1.5g二苯胺溶於100ml冰醋酸中，添加1.5ml濃硫酸，裝入棕色瓶，貯存暗處，使用時加0.1ml乙醛液〔濃乙醛：H2O＝1：50（V／V）〕。
12、1.0mol/L高酸溶液（HClO4）。
13、0.05mol/LNaOH。
14、DNA標准液：取標准DNA25mg溶於少量0.05mol.L-1NaOH中，再用0.05mol/LNaOH定容至25ml，後用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加5.0ml1mol/LHClO4，混合冷卻後用0.5mol/LHClO4定容至刻度，則得100μg/ml的標准溶液。

Ⅸ fish實驗步驟及原理

1、脫蠟：
1）二甲苯脫蠟3次，每次5min；
2）100％酒精兩次，每次2min；
3）移出酒精，斜置切片，標記末段向下，空氣乾燥。
2、蛋白酶處理:
1）每個染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配製方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中預熱。將消化酶液加入管內，搖動直到酶溶解。
2） 37℃水浴槽中預熱染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20min。
3） ×SSC在室溫下漂洗切片3次，每次1min。
4）梯度酒精脫水（-20℃預冷）。
3、變性：
1）每一個立式染色缸配製40ml變性溶液；
2）78℃水浴槽中平衡預熱混合液染色缸；
3）78℃孵育8min；
4） 即移入-20℃預冷70%酒精的染色缸內2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃預冷酒精內，每缸2min；
5）空氣乾燥。
4、雜交：
1）准備探針；
2）取一個較大的濕盒，交叉放置切片；
3）滴10μl探針在切片的組織上，加蓋玻片；
4）蓋上濕盒蓋，37℃孵育12h～16h。
雜交後的水洗：
5）鑷子小心去除蓋玻片；
6）43℃預熱雜交後水洗溶液40ml水洗切片15min；
7）2×SSC(37℃)洗兩次，每次10min；
8）切片放人染色缸的1×PBS內待檢測，勿使切片乾燥。
檢測：
9）從1×PBS中取出切片，除去過多的水分，避免標本乾燥。把切片放入濕盒內，同時處理4張切片。
10）每張切片使用30μl～60μl羅丹明抗-地高辛抗體或FITC卵白素，室溫下孵育20min；
11）去掉塑料蓋膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室溫下洗3次，每次2min。
擴增：
12）從1×PBS中取出切片，斜置切片使液體排出；
13）每張切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗體，加塑料蓋膜，室溫孵育20min；
14）去掉塑料蓋膜，把切片放人含1×PBS的染色缸。1×PBS室溫下洗3次，每次2min；
15）從1×PBS中取出切片，斜置切片使液體排出；
16）每張切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗體，加塑料蓋膜，室溫孵育20min；
17）1×PBS室溫下洗3次，每次2min。
5、細胞核染色：
1）張切片加10μl～20μl DAPI，覆蓋蓋玻片並在室溫下孵育2～5ml；
2）盡可能快的在熒光顯微鏡下觀察或封閉盒內保存在-20℃冰箱。切片在染色之後1h內可以在顯微鏡下觀察。

Ⅹ 核酸雜交的雜交緩沖液怎麼配置

SSC核酸雜交用緩沖液名稱都查配製
20X SSC比較用配製：
配製量： 1L
配製：
1.准確稱取175.2g氯化鈉
2.准確稱取88.2g檸檬酸鈉
3.溶解於800mL離水
4.加入數滴10mol/L氫氧化鈉溶液調節pH值至7.0
5.加離水定容至1L
注意：按實驗需要裝高壓滅菌10×SSC、5×SSC、1×SSC由20×SSC做相應稀釋