比色演算法

A. 【羅工流式寶典第12式】看似簡單的CFSE增殖檢測居然有這么多講究

細胞增殖研究對於生物體生命特徵的理解、細胞發育與分化的探索、疾病發病機制的解析以及臨床治療方法的安全性評估至關重要。傳統的細胞增殖測定方法，如MTT/CCK8比色法、Br法和3H-TdR同位素摻入法，存在各自的局限性。比色法僅提供細胞總量變化的總體信息，無法在單細胞水平上分析細胞增殖情況；Br法僅能檢測處於S期的細胞，適用於短期檢測；同位素法存在放射性污染的風險。

相比之下，CFSE（羧基熒光素二乙醯基酯）染色方法及其數據分析方法具有顯著優勢，能夠與流式細胞染色技術結合，在單細胞水平上檢測細胞增殖，並進行動態分析。Flowjo等流式分析軟體提供的增殖擬合演算法，能夠得到相對定量的分析結果，從而幫助人們更深入地了解細胞存活或死亡的機制。

CFSE染色的原理是：這種染料能夠自由穿透細胞膜，一旦進入細胞，就會與胞內蛋白不可逆結合，並在細胞內被酯酶水解後釋放出綠色熒光。在細胞分裂過程中，熒光會平均分配至兩個子代細胞中，導致熒光強度隨細胞分裂逐級遞減。這一特性使得CFSE成為檢測細胞增殖的有效工具。

CFSE標記的細胞在體內觀察熒光可以保存長達數周，常用於活體細胞追蹤檢測實驗和用熒光電鏡觀察細胞長期活動的實驗，為細胞免疫和細胞生物學研究開辟了一條新的有效途徑。

CFSE母液的制備需將乾燥粉末溶於DMSO中，終濃度通常為5或10 mM，操作時需嚴格按說明書推薦進行。染料粉末可在≤-20°C下避光長期保存，使用DMSO溶解後建議分裝保存，避免反復凍融，溶液在≤-20°C可穩定3個月。長時間存放會使CFSE的標記率下降。

CFSE染色體系包括細胞洗滌、離心收集、DPBS重懸、CFSE染色、37℃孵育、洗滌離心、含10%FBS的培養基洗滌、重懸於完全培養基、37℃培養、洗滌進行常規流式染色或直接上機操作。染色過程中使用的DPBS是為避免干擾細胞染色，相對PBS效果更佳。細胞染色濃度通常在0.5~50×10^6/ml，具體濃度取決於細胞濃度和抗性。CFSE濃度一般為0.5~5 μM，染色時間通常為3~5 min，染色時間對細胞活性和增殖基本無影響。

體外培養建議原代細胞培養時間在48~96 h之間，48 h後增殖峰開始相對明顯，易於組間比較分析。CFSE熒光亮度會隨細胞增殖分裂逐漸減弱，8-9代增殖後基本無法檢測，因此建議不要超過96 h的培養時間。

數據分析方面，Flowjo軟體提供了增殖數據擬合功能，可通過B站up主「半瓶流式小美膩」的指導進行操作。增殖結果圖示包括未培養對照管、培養但未染色對照管、增殖細胞群體等，結合峰值和擬合結果或直接圈取增殖細胞群體進行組間對比。增殖峰的CV值反映了細胞標記率的差異，不同細胞亞群種類多的表現出相對較大的CV值，而腫瘤細胞等導致分配不對稱程度增加時，無法根據傳統擬合手法計算增殖代數，建議使用增殖區間細胞所佔總細胞數的百分比進行組間比較。

實驗過程中需注意對照設置，包括未培養但染色的對照細胞和培養但未染色的對照細胞，用於確認細胞的初始標記亮度和陰性信號及細胞的自發熒光。在細胞培養過程中，外界因素可能導致細胞生長狀態下降，結合染死活染料排除死細胞干擾。