wb膜封閉液怎麼配置

① 做WB為什麼用牛奶封閉能顯出來 用BSA就顯不出來了

在蛋白印跡 WB 實驗的封閉環節，我們經常疑惑該用脫脂牛奶還是牛血清白蛋白(BSA)來封閉，這兩種封閉稀釋液對實驗有什麼影響？

首先，我們需要了解封閉的目的：減少因非特異性結合而產生的背景。其次，我們需要知道 BSA 和牛奶的區別：BSA 僅由一種蛋白組成，即 60 kDa 的牛血清白蛋白；而牛奶則由許多大小不一的蛋白構成。

所以，CST (Cell Signaling Technology) 推薦牛奶封閉最佳，因為牛奶有更大的機會來減少更多的非特異性結合。我們建議您用經 TBST 稀釋的 5% 牛奶，在室溫下搖晃一小時，來封閉CST所有非偶聯一抗，這包括磷酸化特異性和總抗體。

現在，曾有同學問過，「牛奶中的磷酸酶會怎麼樣？」 或許有一些文章反對使用牛奶來檢測磷酸化信號，這一誤區的出現可能是由於實驗者使用了非實驗級奶粉引起的（國內許多奶粉含有磷酸酶等雜質），但在 CST 的所有內部檢測中，科學家們進行了多次蛋白印跡實驗，從未發現任何這樣的問題。CST建議轉膜後迅速在TBS中洗滌膜幾秒，以便移除殘留的轉膜緩沖液，隨後使用5%脫脂牛奶（請使用實驗級的#9999）的TBST室溫封閉1h。另外，CST科學家們每天至少要新鮮配製一次牛奶，有時甚至一天配製多次，因為如果牛奶緩沖液放置了一周、兩周甚至更長時間不使用，那麼磷酸酶影響信號的機率將會增加。

上圖是(Phospho-Akt (Thr308) (D25E6) XP® Rabbit mAb) #13038 用來檢測經 PDGF 處理的 3T3 細胞裂解物的結果圖片。左側膜是用牛奶封閉，右側膜用 BSA 封閉。顯然，用 BSA 封閉的膜的背景更高。但用牛奶封閉膜時，磷酸化信號仍然很強且清晰。

封閉後，請仔細查看一抗的說明書，根據推薦的一抗緩沖液來稀釋一抗，一般推薦牛奶或 BSA，但取決於不同抗體。

② wb洗膜配置

wb洗膜配置1X轉膜緩沖液採用甘氨酸2.9g、Tris 5.8g、SDS 0.37g、濃鹽酸1.8 ml 、蒸餾水至800ml、加甲醇200ml定容至1000ml。
10X 轉膜緩沖液的配置是甘氨酸151.1g、Tris 30.3g、蒸餾水至1000ml
溶解後室溫保存，用時稀釋10倍，並加入甲醇至20%。通常取80ml母液，加560ml蒸餾水，最後加160ml甲醇，配製成800ml即可。（先加甲醇易產生沉澱）。

③ wb脫脂牛奶怎麼配

推薦用TBST進行稀釋獲得5%的牛奶封閉（5g/100mL）。脫脂牛奶封閉後背景比較干凈，而檢測磷酸化蛋白則用BSA（因脫脂牛奶含有較多的磷酸化蛋白，會干擾的）。
一、牛血清白蛋白(BSA)，又稱第五組分，是牛血清中的一種白蛋白，包含583個氨基酸殘基，分子量為66、430 kDa，等電點為4、7。牛血清白蛋白在生化實驗中有廣泛的應用，例如在western blot中作為Blocking agent;在酶切反應緩沖液中加入BSA，通過提高溶液中蛋白質的濃度，對酶起保護作用。防止酶的分解和非特異性吸附，能減輕有些酶的變性，能減輕有些不利環境因素如加熱，表面張力及化學因素引起的變性。
二、用途說明：
1、 在酶切反應緩沖液中加入BSA，通過提高溶液中蛋白質的濃度，對酶起保護作用。防止酶的分解和非特異性吸附，能減輕有些酶的變性，減輕不利環境因素如加熱，表面張力及化學因素引起的變性的。
2 、ELISA中也常常用到，比如封閉液，樣本稀釋液，酶結合物稀釋液都可以用BSA。
3、生化研究，遺傳工程和葯物研究。

④ southern blot 牛奶封閉液如何配置

Southern Blot 為什麼要配牛奶封閉液啊？是最後孵育的一部要加抗體嗎？
如果是封閉抗體的話，一般就配5%的脫脂奶粉，5%多半指的是個g/100ml。也就是5g奶粉，100ml水的比例，完全溶解即可。如果擔心牛奶裡面有小顆粒沒有溶解，可以用0.22um的膜過濾一下，防止有顆粒在膜上形成斑點的背景。

⑤ western blot中封閉起什麼作用

轉膜後，膜上其他的空白位置需要用封閉液封閉。Western的靈敏度某種程度上受限於封閉做的好不好。

在做Western blot實驗中，會用到固相載體(如NC膜，PVDF膜)，在這些固相載體表面有很多洞洞，通過電轉，膠上的蛋白被轉移到膜上，蛋白以機械填補(堆積)和吸附的方式結合於表面。

蛋白塞進了表面的很多洞洞裡面，但是蛋白並不是連續的，而有很多空隙，抗體也是蛋白，也會被吸附在空的洞里，這樣就會有很多非特異性的信號。

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封閉液中的蛋白可以與固相載體表面的空白位置結合，以機械填補(堆積)和吸附覆蓋的方式結合在膜上，填補和覆蓋蛋白結合位點以避免非特異性結合。同樣，這兩種作用使封閉液中的蛋白能夠狠牢固結合在空白位置上，這樣抗體蛋白就不會被非特異性的吸附到膜上，而只會跟特異性蛋白結合。

封閉液應封閉所有的未結合位點而不替換表面上的靶蛋白，不結合靶蛋白表位，也不與抗體或檢測試劑有交叉反應。

轉膜後，膜上其他的空白位置需要用封閉液封閉。Western的靈敏度某種程度上受限於封閉做的好不好。

⑥ 配wb脫脂奶粉封閉液是用tbst還是tbs

用加脫脂奶粉封閉液用TBST液顯色用紅外熒光二抗則能用TBS液稀釋

⑦ 求封閉液中1%的BSA是怎麼配製

取1g BSA，加蒸餾水，定容到100ml就行了。

最常用的封閉劑是0.05%-0.5%的BSA，封閉是否必要，取決於ELISA的模式及具體的實驗條件。並非所有的ELISA 固相均需封閉，封閉不當反而會使陰性本底增高。

一般說來，雙抗體夾心法，只要酶標記物是高活性的，操作時洗滌徹底，不經封閉也可得到滿意的結果。

特別是用單抗腹水直接包被，因其中大量非抗體蛋白在包被時同樣也吸附在固相表面，業已起到了類似封閉劑的作用。但在間接法測定中，封閉一般是不可少的。

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判斷封閉條件，要考慮在此條件下是否能達到試驗要求，即棋盤滴定要滿足：陽性樣品OD=0.8、陰性樣品OD<=0.1，而不是看你待測樣品OD變化趨勢;

過低封閉濃度勢必造成本底過高，但過高又會使靈敏度降低，因此只要選擇能夠滿足你試驗要求的最低BSA濃度就可以了。

另外提醒，洗滌一定要徹底，很重要的。

包被後封閉前一般要洗滌一遍，以便於洗掉結合不牢固的包被物，防止在實驗中影響實驗結果;封閉後一定不要洗滌，封閉的目的就是要靠蛋白填補未被包被物佔領的空間，另外封閉液一般也具有保護作用。

如果不是用biotin-avidin系統的話，用5%脫脂奶粉做封閉液就可以了，廉價，效果也很好。

封閉液一般是用5%的BSA或者是用5%的脫脂奶粉，溶劑一般使用TBST。做實驗的時候，我一直強調這樣的一個原理，那就是在了解原理的基礎之上，我們完全可以不拘泥於書本，進行創造。就拿這個封閉液來講，要是單純的一種封閉效果仍然不好的話，我們完全可以兩種合用，我就試過1%的BSA和5%的脫脂奶粉合用進行封閉的事例。所以，搞科學研究是需要我們進行再創造的。

D、BSA交聯抗原注射到兔子體內得到一抗，我們Elisa的二抗用的是羊抗兔HRP標記的二抗。請問，在封閉時，用什麼樣的封閉液比較好呢?是無蛋白封閉液，還是羊的免疫前血清?

⑧ WB封閉液與一抗稀釋液一定要一致嗎

要一致。用牛奶封閉就用牛奶稀釋，BSA封閉就BSA稀釋。高保真生物技術有限公司，實驗整體外包服務商。you can contact me, Q :four zero six zero eight eight four six three

⑨ WB封閉溫度和時間

WB封閉溫度是38度1個小時就可以了。
如果是自己配置的封閉液，最好過濾一下以消除固體雜質。