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sirna產品如何配置

發布時間: 2022-09-23 04:18:05

A. 如何選擇siRNA轉染試劑

多查多問多試驗

市面上的轉染試劑品種很多,商家們還在不斷推出新產品,如此多的選擇難免令人感到無所適從,怎樣才能找到最適合自己的產品呢?轉染試劑的選擇主要取決於細胞類型、細胞種屬和下游實驗。

細胞系不同,它們所需的轉染條件自然也不相同。舉例來說,懸浮培養的鼠類原代細胞,就比貼壁培養的人類細胞更難轉染。此外,神經元和巨噬細胞也令人頗為頭疼,標准方法很難將siRNA轉染進去。

不論是哪種情況,經驗數據都具有無可取代的價值。查閱文獻,與其他研究者多交流都能獲得寶貴的信息。當然,我們也可以在供應商提供的資料中,查看已成功轉染的細胞類型。盡管這些資料中可能並沒有siRNA轉染的專門信息,但了解轉染試劑已經成功轉染了哪些細胞,是很有幫助的。

此外,我們可以向商家索要一點樣品,或者向同事借用一些,對自己的細胞進行試驗。幸運的話,在幾天內就可以鎖定合意的產品。在這里花少許時間,總好過因為實驗結果不理想而要重頭再來吧。

B. 體積、葯劑量、濃度比例關系換算

一、葯物濃度的表示方法
葯物濃度是指一定量液體或固定製劑中所含主葯的分量。表示混合物組成標度的量可分為4類:1.「分數」;2.「質量濃度」;3.「比例濃度」;4.「濃度」。在醫療工作和動物實驗中最常用的是「分數」和「質量濃度」,有時也用「比例濃度」和「濃度」。
1.「分數」
由於葯物或溶液的量可以用體積或重量表示,因此有不同的表示方法。
(1)質量分數:即每100g制劑中含葯物克數,適用於固體葯物,如10%氧化鋅軟膏100g中含氧化鋅10g。
(2)體積分數:即100ml溶液中含葯物的毫升數。適用於液體葯物,如消毒用75%乙醇,即100ml中含無水乙醇75ml,相當於質量分數75%乙醇。
2.質量濃度
即每升溶液中含葯物的克數或毫克數,單位g/L或mg/L。如原來的5%葡萄糖即每100ml含葡萄糖5g。此法最常用。

C. siRNA實驗方法和設計常見問題解答

Q:如何選擇轉染方法和轉染試劑?

A:我們的siRNA適用於各種轉染方法。轉染方法和轉染試劑的選擇,需要根據細胞來選擇,對於容易轉染的細胞,常用的轉染方法是脂質體轉染。

Q:對於難轉染的細胞,應該如何提高其轉染效率?轉染效率又該如何確定?

A:1)對於貼壁細胞,推薦採用轉染試劑轉染即可;2)對於難轉染的細胞的轉染,如何提高轉染效率的問題也是目前研究的技術難題。一般建議使用電轉的方法,但是由於電轉的方法對細胞損傷比較大,該方法也未必是最佳的。

轉染效率的確定,常用的是使用熒游標記的siRNA,通過熒光顯微鏡,共聚焦顯微鏡,流式細胞儀檢測的方法。具體可以參考我們的產品說明書。

Q:細胞的轉染效率是否與siRNA序列相關?

A:轉染效率的高低取決於與細胞自身及轉染方法,而於siRNA的序列並沒有直接關系。因此,siRNA在不同的細胞轉染效率可能不一樣。

Q:轉染siRNA時候的細胞密度多少為宜?

A:依不同的轉染方法或轉染試劑而定。如使用lipofectamine 2000作為轉染試劑,單獨轉染siRNA,30%~50%密度較佳;而siRNA與質粒共轉染,密度可以到80%-90%。

Q:siRNA轉染時的培養基要求,可否含血清?

A:不同的轉染試劑可能有不同的要求,對於lipofectamine 2000,在配製siRNA和lipofectamine 2000混合物時不能含有血清,但細胞培養基可以含有血清,但不能含有抗生素。

Q:siRNA的儲存液體濃度和工作濃度有何區別?

A:siRNA的貯存濃度就是保存的最佳濃度,銳博推薦的貯存液濃度為20 μM;而siRNA的工作濃度就是使siRNA能夠達到最佳沉默效果的轉染濃度,一般10~100 nM范圍內,銳博生物推薦的轉染濃度是50nM。

Q:轉染時該如何分組?分組的目的是什麼?

[圖片上傳失敗...(image-67e513-1654668332888)]

Q:為什麼說陽性對照在RNA干擾實驗中很重要?

A:陽性對照作為一個實驗系統檢查是很重要的。也就是說,當您看到siRNA陽性對照的預期實驗結果時,您能確保在您的實驗方法中您的轉染、RNA提取物和檢測方法是可靠的。

Q:陽性對照及其陰性對照在RNAi實驗中的作用?如何選擇?

A:陽性對照指的是已經驗證的針對看家基因或報告基因有效的siRNA,用於監測實驗體系和實驗方法的可行性。我們可以提供的陽性對照siRNA有針對GAPDH,ACTB,GFP/EGFP有效的siRNA作為陽性對照,客戶可以根據具體的實驗需要選擇。陰性對照往往是非特異的siRNA,主要用於說明siRNA作用的特異性。陰性對照的選擇可以是通用的序列(universal)或是隨機打亂的序列(scramble),客戶可以根據實驗要求選擇。

Q:用熒光對照siRNA如何檢測轉染效率?是不是每次實驗都必須做?

A:我們提供的轉染對照siRNA帶有Cy3或Cy5熒游標記,可以通過熒光顯微鏡,共聚焦顯微鏡,流式細胞儀等熒光檢測儀器檢測。 除此之外,還應該通過陽性對照實驗進一步確定。轉染效率的高低主要與細胞自身相關,同等實驗條件下,每次轉染細胞轉染效率應該是相近的,因此可以不必每次都做。但如果每次實驗都做一個熒光對照組,將會更加便於排除一些實驗問題。

Q:siRNA熒光染料的最大吸收率和發射率各在哪個波段?

A:FAM在495nm處有最大吸收率,在520nm處有最大發射率。

Cy3在550nm處有最大吸收率,在565nm處有最大發射率。

Cy5在643nm處有最大吸收率,在667nm處有最大發射率。

Q:轉染後出現細胞死亡是什麼原因?如何優化轉染條件?

[圖片上傳失敗...(image-6ee094-1654668332888)]

Q:到了轉染時間發現細胞密度太低,該如時轉染還是讓細胞多長一天再轉染?

A:細胞生長需要一定的密度,而轉染試劑對細胞有一定的毒性,如果轉染時細胞密度過低,細胞可能會因此生長異常甚至死亡。轉染前要求良好的細胞狀態和細胞活性,一般也不建議用生長幾天的細胞做轉染。

Q:siRNA的作用效果應該如何檢測?

A:通常可以從三個方面來相互驗證siRNA的作用效果

3)根據目的基因的功能,從細胞表型的水平檢測。

Q:siRNA在細胞內可以作用多長時間?什麼時候才是最好的檢測時間?

A:siRNA介導的RNAi屬於瞬時現象,不能穩定傳代,一般其作用時間不可能維持很長時間,通常建議在轉染後3 4天內完成檢測。最佳檢測時間,因細胞、目的基因而異,多在轉染後24 48小時之間檢測。

Q:為什麼要強調mRNA水平檢測?可以直接檢測蛋白和功能嗎?

A:siRNA直接作用於mRNA,因此mRNA水平檢測是最直接在指標。

很多客戶認為,mRNA的降解直接的結果應該是對應蛋白質含量的下降,因此蛋白水平的檢測結果也應該可以作為有效性的檢測指標。事實上,很多情況下往往出現,mRNA下降水平與蛋白下降水平不對應的現象。其可能原因有:

Q:干擾效率多高才是好的靶點?

A:沒有明確的界定,干擾效率高低因不同的細胞類型和不同的基因而異。不同細胞類型的轉染效率也不盡相同,不同基因的表達水平也相差較大,主要看干擾效果而定。

Q:沉默效果不理想,應該如何處理?

A:最常見的影響沉默效果的兩個原因是:轉染效率低和siRNA序列設計的效果不理想。如果您初次使用siRNA或採用了新的細胞系,並發現沉默效果不佳,我們建議您對轉染效率進行檢測,並選擇優化轉染條件。如果您已經對實驗轉染條件進行優化但是問題依然存在,我們建議您換用另一種轉染試劑或是採用其他技術,這也許能提高轉染效率。如果已經提高了轉染效率但是沉默效果仍然未達到要求,可能是因為siRNA序列設計的效果不理想。

Q:siRNA反而使得目的基因表達上調了,這是什麼原因?該怎麼解決?

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Q:我從陰性對照實驗中得到和特異性RNAi相同的結果,這說明了什麼?

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Q:各組陰性對照的檢測結果是否應該一樣?如果偏差很大該怎麼辦?

A:正常情況下,各組陰性對照的檢測結果應該是相近的。如果偏差過大,只需考慮實驗結果的准確性。另外,對於一些特定的基因,比如與細胞難受壓力相關的基因,又如參與細胞免疫的基因,可能會對外界壓力比較敏感,使得各組對照的基因表達發生變化不一致。

Q:用100nM 的siRNA轉染時只得到50%沉默效率,我可以把siRNA的濃度增加到200nM甚至400nM嗎?

A:當干擾效率不佳時,可以在一定范圍內適當優化轉染濃度,通常優化的范圍是10~150nM,但不宜過大,高濃度的siRNA將可能增加非特異性作用的可能性並對細胞產生毒性。

Q:同樣的siRNA,為什麼在細胞A很有效,在細胞B則沒有效果?

A:不同細胞的轉染效率不一樣、基因表達水平也不一樣,這些都與siRNA的作用效率有關
siRNA實驗方法和設計常見問題解答- 答疑集錦- 非編碼RNA研究策略-銳博技術專題專題—丁香園會議頻道 (dxy.cn)

D. siRNA轉染答疑專題總結(下)

Q9: 剛開始做實驗,准備把RNAi的片段轉入染色體內穩定表達,不知道是shRNA還是siRNA哪個比較好而且效率比較高?另外,一個載體里同時放兩個針對不同基因的shRNA會不會相互影響?

A9: 穩定轉染當然是shRNA。關於一個載體2個shRNA,涉及到2個shRNA的表達和加工的問題,關鍵還是2個shRNA都需要順利表達的問題,這就和你的載體,以及2個shRNA在載體的排列有關系。至於蛋白之間的相互影響,應該考慮到了。

Q10: 用慢病毒來包裝siRNA來轉染細胞,如何確定轉染成功的細胞具有穩定性?這種細胞最多能夠穩定傳代多少代啊?

A10:我理解你的穩定性是指在子代細胞中也同樣出現RNAi效果。瞬時轉染的siRNA會在培養傳代過程中,不斷被降解稀釋,以至消失。如果需要在子代中也永久有RNAi,必需將相關siRNA基因整合到細胞基因組中,並表達。一般來說,如果感染並傳代2周以後,RNAi效應仍然非常明顯,可以初步認定是穩定的。穩定傳代的細胞系根據細胞的不同,可以傳很多代的。

Q11: NCBI里查到的目的基因有3個mRNA,但是合成siRNA只能選擇其中一條mRNA , 目前已有的文獻也沒有做這個的,該如何選擇呢?

A11: 3個mRNA可能至少產生3個蛋白,研究哪個蛋白就選和這個蛋白相關的mRNA,如果不產生蛋白,就根據獨立的功能對應的mRNA來研究,如果是研究這個基因的全部功能,就分各個mRNA來分別研究。

Q12: 陰性對照應該是與目的基因的序列無同源性的,那如何評價轉染效率?

A12: 帶熒光的siRNA,不考慮序列,轉染進去細胞內即可出現熒光,故可用於優化轉染條件和評估轉染效率。而沉默效率則和siRNA序列相關。

Q13: 請問細胞水平實驗,選擇載體表達的shRNA還是小片段的siRNA?
請問兩種在轉染效率和沉默時間等有什麼區別呢?

A13:根據實驗需要沉默的時間來確定是用shRNA還是siRNA,1周以內的短期抑制,採用siRNA較好,無需構建載體,節省時間,還可以採用2次轉染的方法,延長RNAi作用的時間到2周。2周以上長效RNAi實驗,採用shRNA表達載體較好,效應持續時間長,缺點的需要構建相關載體。效率上,根據具體細胞,實驗情況,各有千秋。

Q14: 轉染後背景很臟,都是黑點(疑似黑焦蟲)在原地運動。做了LB檢測,確定該黑點不是細菌,最後發現黑點來源於抽提的質粒,請問有什麼辦法可以解決嗎?

A14: 這種黑點,如果確定不是細菌,多是凝聚的蛋白,還有DNA等的沉澱產物,有人又把它叫「黑膠蟲」。人們看到可以動,認為是生物,其實只是布朗運動。這和血清、細胞、轉染試劑等都有關系。如果不影響實驗,可以通過換液來除去。

Q15: 慢病毒轉染多長時間後進行干擾目的基因和蛋白的檢測?

A15:如果用慢病毒進行瞬時表達,一般至少需要24-48小時,慢病毒基因組是RNA,需要反轉錄成DNA,再生成siRNA,再干擾,才會發生作用。這個過程和細胞類別、細胞活性、慢病毒具體載體等等有關系。建議取不同時間點檢測。另外,慢病毒一般都帶篩選基因,可以考慮做穩定表達。如果只做瞬時表達,可考慮用轉染試劑,成本、時間、方法都要省很多。

Q16: 21nt,22nt,24nt的siRNA如何進行電泳分辨?

A16:PAGE分析,即聚丙烯醯胺凝膠電泳,理論上可以分辨1bp,實際上,在引物的純化中也常用此種凝膠進行純化。但由於siRNA很容易降解,尤其在電泳時,需要接觸的液體、器皿等都很多,很容易造成在電泳過程中的降解,這樣電泳就不易分辨了。如果一定需要分辨,可以採用HPLC或質譜的方法。

Q17: RNAi很容易降解,轉染效率很低。EntransterTM產品一般採用什麼策略和技術來防範呢?

A17:RNAi中,標準的非修飾的siRNA確實容易降解,這不僅在保存過程中,而且在轉染過程中。對siRNA的降解,可以合成修飾的雙鏈siRNA,以提高合成中的穩定性,使用合成好的siRNA,盡量嚴格做到不要受RNA酶的污染。對轉染來說,因為要接觸血清,培養基以及細胞內酶的作用。這時,好的轉染試劑作用就顯現出來了。要做到在血清中游離時,保護siRNA不受培養基中酶和蛋白的降解、吸附等影響,同時在進入細胞後不被溶酶體降解,並能釋放到細胞質中。好的轉染策略還不僅有保護的作用,更重要的是濃縮siRNA,不將細胞外的其他成分,特別是毒性成分,如抗生素、過多的蛋白帶入細胞,以避免細胞產生毒性反應,毒性對RNAi實驗來說,影響非常大。

E. cell signaling technology 的sirna怎麼樣

產品使用信息
CST 建議轉染 100 nM SignalSilence® siRNA 48 至 72 小時後,再進行細胞裂解。對於轉染流程,請遵照轉染試劑製造商提供的實驗步驟。如有任何使用問題,請隨時聯系 CST。
每個小瓶含有相當於 100 次轉染的用量,對應於每次轉染時 24 孔板中的最終 siRNA 濃度(100 nM),每個孔的總量為 300 μl。
存儲
SignalSilence® siRNA 保存在無 RNA 酶的水中。分裝並保存在 -20ºC 下。
產品說明
Cell Signaling Technology (CST) 的 SignalSilence® siRNA 能讓研究人員使用 RNA 干擾特異性地抑制 靶基因表達,這種方法通過將雙鏈 RNA 分子遞送到細胞內使基因表達選擇性沉默。CST 的所有 SignalSilence® siRNA 產品均已經過嚴格的內部測試,並且蛋白質印跡分析表明可降低靶蛋白表達。
質量控制
通過三苯甲基分析來逐個鹼基地監視寡核苷酸合成,以確保合適的偶聯效率。隨後通過親和固相萃取來純化寡核苷酸。使用質譜分析法進一步分析退火的雙鏈 RNA,從而驗證雙鏈的確切組分。使用質譜分析法將每個批次與上一批次進行對比,以最大程度確保批間一致性。

F. siRNA 生物合成和化學合成有什麼區別嗎

就可以自行解決所有問題你以上的這些問題。 1,要增加RNA體內或者體外轉染的次數。 2、siRNA的化學合成。 4。 3、可以直接注射。時間比較長的話、可以、一般基因沉默效果在72h內檢測,但是最後用脂質體等加以包裹,許多轉染試劑都可以用於siRNA的轉染至細胞,以防RNA被降解,只要看1-2篇文獻,一般德國dharmacon或者美國的Ambion產品

G. 化學合成的SiRNA能直接注射到動物嗎

你以上的這些問題,只要看1-2篇文獻,就可以自行解決所有問題。
1、可以直接注射,但是最後用脂質體等加以包裹,以防RNA被降解。
2、可以,許多轉染試劑都可以用於siRNA的轉染至細胞。
3、一般基因沉默效果在72h內檢測。時間比較長的話,要增加RNA體內或者體外轉染的次數。
4、siRNA的化學合成,一般德國dharmacon或者美國的Ambion產品。

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