配置pcr體系時需要加哪些

A. PCR體系怎麼配

PCR Buffer50 mM KCl, 10 mMTris-HCl, 2.5 mMMgCl2, pH 8.3

200μM dNTPs指25ul體系中的dNTPs的終濃度。

0.2 μM invA primers,0.2 μM終濃度的配對鏈引物。

0.2μM sefA primers, 0.2 μM終濃度的自身鏈引物(下游引物)。

and 0.5 μM pefA primers

2.5U of Taq DNA polymerase，2.5U的Taq酶，一般Taq酶都是5U/ul的。

and 0.2μl of DNA template，0.2ul DNA模板。

剩餘的體積用無菌水補足25ul。

(1)配置pcr體系時需要加哪些擴展閱讀

設計PCR 引物時的一般原則：

1、引物長度- 一般15~ 30鹼基，過短則特異性低; 過長則會引起引物間的退火而影響有
效擴增。

2、 避免內部二級結構，避免序列內有較長的迴文結構，使引物自身不能形成發夾結構。

3、G/C 和A/T 鹼基均勻分布，G/C 含量在45%~ 55% 之間，引物鹼基序列盡可能選
擇鹼基隨機分布，避免嘌呤、嘧啶的連續排列。

4、要避免兩個引物間特別是3' 末端DNA 序列互補以及同一引物自身3' 末端的序列互
補，使它們不能形成引物二聚體或發卡結構。

5、引物3' 端鹼基一般應與模板嚴格配對，並且3' 端為G、C 或T 時引發效率較高。

6、 引物5' 端鹼基可不與模板匹配，可添加與模板無關的序列(如限制性內切酶的識別
位點、ATG 起始密碼子或啟動子序列等)。

B. 20微升pcr反應體系各種反應物分別應該加多少

10×擴增緩沖液2ul，4種dNTP混合物，各200umol/L 2ul，引物各10～100pmol 0.5ul，模板DNA 0.2ug，Taq DNA聚合酶0.2ul，Mg2+1.5mmol/L 1.5ul，加雙或三蒸水至20ul。

PCR所用的酶主要有兩種來源：Taq和Pfu，分別來自兩種不同的噬熱菌。其中Taq擴增效率高但易發生錯配。Pfu擴增效率弱但有糾錯功能。所以實際使用時根據需要必須做不同的選擇。

(2)配置pcr體系時需要加哪些擴展閱讀：

PCR反應五要素：參加PCR反應的物質主要有五種即：引物(PCR引物為DNA片段，細胞內DNA復制的引物為一段RNA鏈）、酶、dNTP、模板和緩沖液（其中需要Mg2+）。

DNA在高溫時也可以發生變性解鏈，當溫度降低後又可以復性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，加入設計引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。